Desenvolvimento e validação de ELISA indireto utilizando a proteína rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis para o diagnóstico de linfadenite caseosa em caprinos

Desenvolvimento e validação de ELISA indireto utilizando a proteína rCP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis para o diagnóstico de linfadenite caseosa em caprinos

• Autor
• Mônica Ellen da Costa Soares
• Co-autores
• Francisco Silvestre Brilhante Bezerra , Maria da Conceição Rodrigues Fernandes , João Ivysson Assunção Silva , Ana Carolina Souza Maia
• Resumo

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  O diagnóstico sorológico da linfadenite caseosa (LC) tem se tornado a principal forma de detecção e controle da doença, sendo o principal teste sorológico para a detecção o ensaio de imunoabsorção enzimática (do inglês enzyme linked immunosorbent essay – ELISA). A proteína recombinante rCP01850 de C. pseudotuberculosis se mostrou um alvo promissor na detecção da LC através do diagnóstico sorológico, já tendo apresentado uma sensibilidade de 92,5% e uma especificidade de 90% para a detecção da doença em ovinos. No entanto, para ser utilizado em caprinos, esse teste de ELISA tem que ser validado para a espécie. Deste modo, objetivou-se padronizar e validar o ELISA indireto utilizando a proteína recombinante rCP01850 para o diagnóstico de LC em caprinos. Um total de 100 amostras de soro caprino foram reservadas para estabelecer a validação dos parâmetros do ELISA com antígeno recombinante, sendo 50 negativas, provenientes de rebanhos livres de LC e caprinos com até 1 ano de idade, e 50 amostras positivas, provenientes de caprinos sintomáticos apresentando abcessos, com o isolamento da C. pseudotuberculosis e caracterização bioquímica. Adicionalmente, um ELISA indireto utilizando antígenos secretados da cepa cp1002 com especificidade de 98,5% e sensibilidade 93,5% para soro caprino, foi usado para confirmar o status positivo da infecção dos 50 animais. A proteína rCP01850 foi expressa através da cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) Star, utilizando o plasmídeo recombinante pAE/cp01850, tendo sido também purificada e liofilizada. O desenvolvimento do ELISA indireto teve como base a metodologia do checkerboard titration para a seleção da melhor concentração da proteína recombinante, foram testadas as diluições 0,25µg/ml, 0,5µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml do antígeno proteico, utilizando para cada uma três colunas da placa, e quatro diluições do soro (1:400, 1:200, 1:100 e 1:50), onde cada diluição ocupava duas linhas na placa, para identificar, nesta etapa, a melhor concentração de antígeno a ser utilizada. Em seguida, para descobrir a diluição ideal do soro dentre as utilizadas, as diluições (1:400, 1:200, 1:100 e 1:50) seriam distribuídas em três colunas cada, em uma nova placa, enquanto nas linhas desta placa, foram utilizadas quatro diluições da IgG anti-cabra conjugada com peroxidase (1:40.000, 1:20.000, 1:10.000, 1:5.000), a fim de identificar a melhor concentração do soro dos animais e do anticorpo conjugado a serem utilizados, tendo os valores resultantes de densidade óptica (DO) mais altos dos controles positivos e os mais baixos dos controles negativos, usados como referência. A proteína foi expressa e as amostras caracterizadas com sucesso, no entanto, com a suspensão das atividades laboratoriais na universidade devido à pandemia do COVID-19, não foi possível concluir o a padronização do ELISA indireto para caprinos utilizando a proteína rCP01850.

• Palavras-chave
• Linfadenite caseosa, proteína recombinante, rCP01850, diagnóstico, ELISA.
• Área Temática
• Ciências Biológicas

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