PAPEL DA NADPH OXIDASE-2 NA DISFUNÇÃO E MORTE DA CÉLULA BETA PANCREÁTICA

PAPEL DA NADPH OXIDASE-2 NA DISFUNÇÃO E MORTE DA CÉLULA BETA PANCREÁTICA

• Autor
• Eloisa Aparecida Vilas-Boas
• Co-autores
• Lisa Nalbach , Davidson Correa de Almeida , Emmanuel Ampofo , Angelo Rafael Carpinelli , Leticia Prates Roma , Fernanda Ortis
• Resumo

• INTRODUÇÃO: No diabetes mellitus do tipo 1 (DM1), uma inflamação específica e persistente nas ilhotas pancreáticas (insulite) leva à disfunção e perda massiva das células beta. As citocinas pró-inflamatórias produzidas durante a insulite contribuem para o desencadeamento do estresse de retículo endoplasmático (RE) e do aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) e estresse oxidativo. Dentre todas as fontes de EROs, as NADPH oxidases (NOX) são as únicas que aparentemente produzem EROs como função principal. As EROs derivadas da NOX são importantes sinalizadoras para a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), porém também podem levar à disfunção das células beta. Apesar de muitos esforços, ainda não somos capazes de distinguir entre a produção fisiológica e patológica de EROs. Algumas limitações têm sido a utilização de sensores redox pouco específicos, que não dizem com precisão o tipo de espécie produzida ou qual o compartimento de produção, além da utilização de inibidores sem especificidade à NOX ou às suas diferentes isoformas. OBJETIVO: Avaliar o envolvimento de diferentes compartimentos (mitocôndria x citosol/núcleo) na produção de EROs em ilhotas pancreáticas expostas a uma combinação de citocinas pró-inflamatórias e o papel da NOX2 na disfunção e morte nessas condições. MÉTODOS: Ilhotas isoladas de camundongos C57BL/6J foram mantidas em cultura com uma combinação de citocinas pró-inflamatórias (IL-1? + TNF + IFN-?). A seguir, avaliamos: 1) a produção estática de superóxido (O2•–) em diferentes períodos, com a sonda DHE por citometria de fluxo; 2) a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) em tempo real e em diferentes compartimentos com o sensor roGFP2-Orp1 expresso exclusivamente na matriz mitocondrial ou no citosol/núcleo e 3) as variações em tempo real dos níveis intracelulares de NAD(P)H. O envolvimento da NOX2 foi avaliado na tolerância à glicose de camundongos wild type (WT) ou NOX2 KO e 2) na produção de O2•–, 3) secreção de insulina, 4) viabilidade celular, 5) homeostase de cálcio e 6) ativação do estresse de RE, em ilhotas WT ou NOX2 KO expostas às citocinas. Adicionalmente, avaliamos o envolvimento de NOX2 na produção de H2O2 em ilhotas WT ou NOX2 KO:roGFP2-Orp1 expostas às citocinas. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do ICB/USP (Protocolo CEUA nº 62/2016). RESULTADOS: Mostramos, pela primeira vez, a variação temporal da produção de EROs em ilhotas expostas às citocinas. Mostramos um aumento de O2•– entre 2 e 8 horas após exposição às citocinas e um papel principal do citosol/núcleo, e não da matriz mitocondrial, na produção de H2O2 induzida por citocinas, com pico entre 4 e 5 horas. O pico de H2O2 citosólico/nuclear coincide com uma diminuição de NAD(P)H intracelular e foi completamente eliminado em ilhotas NOX2 KO:roGFP2-Orp1. Animais NOX2 KO apresentaram melhor tolerância à glicose e suas ilhotas foram protegidas da disfunção secretória e da morte induzida por citocinas. Curiosamente, a ausência de NOX2 piorou o influxo de cálcio em resposta à glicose em ilhotas expostas às citocinas, porém não observamos relação entre a NOX2 e o mecanismo de entrada de cálcio operada por estoque (SOCE) ou estresse de RE induzido por citocinas. CONCLUSÃO: Propomos que a inibição da NOX2 é um possível alvo terapêutico contra a disfunção precoce de células beta induzida por citocinas pró-inflamatórias no contexto do DM1.

• Palavras-chave
• diabetes tipo 1, células beta pancreáticas, insulite, espécies reativas de oxigênio, estresse oxidativo, citocinas pró-inflamatórias, NADPH oxidase, NOX2.
• Área Temática
• Fisiologia Endócrina