ENVOLVIMENTO DA N-GLICOSILAÇÃO NO TRANSPORTE DE NH3 ATRAVÉS DO TRANSPORTADOR DE UREIA A2

ENVOLVIMENTO DA N-GLICOSILAÇÃO NO TRANSPORTE DE NH3 ATRAVÉS DO TRANSPORTADOR DE UREIA A2

• Autor
• Jessica Kabutomori
• Co-autores
• Neydiana Pina-Lopes , Raif Musa-Aziz
• Resumo

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  INTRODUÇÃO: Transportadores de ureia (UTs) são glicoproteínas de membrana que facilitam o transporte passivo de ureia através das membranas celulares, desempenhando um papel importante no mecanismo de concentração urinária, fundamental para a manutenção da osmolaridade plasmática. Há quatro isoformas renais: UT-B, presente nos vasos retos descendentes; UT-A1 e A-3, expressos, respectivamente, nas membranas apical e basolateral do ducto coletor medular interno e UT-A2, expresso no segmento descendente fino da alça de Henle. A estrutura cristalina do UT-B de bovino mostra que os UTs formam homotrímeros e cada monômero é constituído por dez segmentos transmembranais (TMs) e 2 a-hélices (Pa e Pb) que formam um canal independente para a passagem de ureia. Entre o TM 5 e a a-hélice Pb há uma alça extracelular longa que contém um resíduo de asparagina (N, Asn) que funciona como sítio de N-glicosilação ¾ uma modificação pós-traducional importante para função biológica de diversas proteínas de membrana. Recentemente demonstramos que, quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus, os UTs também transportam água através do poro monomérico para ureia. Geyer et al. (2013), por sua vez, demonstraram que a proteína UT-B, quando expressa em oócitos de Xenopus laevis, além de água e ureia, pode transportar NH₃. OBJETIVOS: Considerando que no néfron, os UT-As estão em locais envolvidos com o manejo renal de amônia (NH₃/NH₄⁺), este estudo visa investigar se o UT-A2 de camundongo (m) transporta NH₃, bem como qual o papel da N-glicosilação na expressão e função de transporte dessa proteína. METODOLOGIA: Para isso, o resíduo de Asn foi substituído por Glutamina (Q), gerando o mutante mUT-A2^N210Q, que não pode ser N-glicosilado. Oócitos de Lithobates foram injetados com cRNA para mUT-A2 Wild Type (WT), mUT-A2^N210Q ou injetados com H₂O (controle). A expressão heteróloga das proteínas mUT-A2 WT e mutante na membrana dos oócitos foi avaliada por experimentos de biotinilação e western blot. Para confirmar a presença da N-glicosilação, amostras biotiniladas de mUT-A2 WT foram tratadas com PNGase F, enzima que remove a N-glicosilação do resíduo de Asn de proteínas. O transporte de NH₃ foi avaliado através da técnica de medidas do pH de superfície (pH_S)  que utiliza um microeletrodo de vidro com ponta romba, sensível a H⁺, para medir as variações de pH que ocorrem na superfície dos oócitos devido ao influxo resultante de NH₃ [(?pH_S(NH3)]. RESULTADOS: Os dados de western blot mostram que os oócitos são capazes de expressar as formas glicosiladas das proteínas mUT-A2 e que a N-glicosilação é essencial para a expressão dessa proteína na membrana. As medidas de ?pH_S(NH3) revelam que oócitos que expressam mUT-A2 WT exibem um ?pH_S(NH3) significativamente maior [0,093±0,01 (n=3)] que àquela para mUT-A2^N210Q [0,028±0,002 (n=3)] ou para oócitos controle [0,27±0,009 (n=7)]. CONCLUSÃO: Desse modo, nossos dados indicam que o mUT-A2 transporta NH_3, além de ureia e água, e que esse transporte é dependente da N-glicosilação no resíduo de Asn na posição 210. Essas observações sugerem uma maior compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos com o transporte NH₃ através da proteína mUT-A2. Todos os estudos com animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de animais (Protocolo nº 7971160519). AGÊNCIA DE FOMENTO: FAPESP (Nº Processo 2018/22855-1) Processo CAPES (Nº Processo 88887.340186/2019-00).

   

• Palavras-chave
• Transportador de Ureia, UT, Amônia, Lithobates catesbeianus.
• Área Temática
• Fisiologia Renal