Análise da via de transporte de água através dos Transportadores de Ureia, quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus.

Análise da via de transporte de água através dos Transportadores de Ureia, quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus.

• Autor
• Neydiana Pina-Lopes
• Co-autores
• Jéssica Kabutomori , Raif Musa-Aziz
• Resumo

• INTRODUÇÃO: Nos rins, os transportadores de ureia (UTs) são responsáveis por facilitar a difusão de ureia através da membrana plasmática, importante para o mecanismo de concentração urinária. Sabe-se que as isoformas de UT são expressas em regiões específica dos rins. UT-A1 e UT-A3 são expressos nas membranas apical e basolateral do ducto coletor medular interno, respectivamente, UT-A2 é expresso no segmento descendente fino da Alça de Henle e o UT-B é expresso na vasa reta descendente. A estrutura cristalina do UT-B bovino (bUT-B) revela que o UT é uma proteína homotrimérica onde cada monômero possui um poro com um filtro de seletividade, através do qual a ureia passa a favor do seu gradiente de concentração. Na região mais estreita de cada poro, foram identificados dois resíduos de Treonina (T) — conservados em todos os UTs — que formam o sítio de ligação da proteína com a ureia. Estudos anteriores com bUT-B demonstraram que a mutação de ambos os resíduos T por Valina (V) reduz o transporte de ureia. Interessantemente, dados recentes produzidos no nosso laboratório demonstram que: 1) oócitos da rã Lithobates catesbeianus, após a injeção de cRNA, expressam as proteínas wild type (WT) de camundongo (m) mUT-A2^WT, mUT-A3^WT ou mUT-B^WT na membrana plasmática e 2) a permeabilidade osmótica à água (P_f) desses oócitos foi significativamente maior que a dos oócitos injetados com H₂O (controle). OBJETIVOS: Investigar o efeito da mutação dos dois resíduos T conservados no filtro de seletividade do poro monomérico do mUT-A2^WT, mUT-A3^WT e mUT-B^WT na expressão dessas proteínas na membrana plasmática e na permeabilidade osmótica à água (P_f). MÉTODOS: Oócitos isolados foram injetados com cRNA de mUT WT versus mutantes [(UT-A2^WT vs UT-A2^T176V e UT-A2^T338V), (UT-A3^WT vs UT-A3^T246V e UT-A3^T408V) e (mUT-B^WT vs UT-B^T172V e UT-B^T334V)] ou injetados com H₂O (controle). A expressão dos UTs na membrana plasmática foi avaliada por biotinilação, seguida por “Western blot” com um anticorpo anti-cMyc. A P_f dos oócitos foi avaliada colocando os oócitos em uma solução hipotônica (70 mOsm / L) e registrando o inchaço celular por meio de microscopia de vídeo. As mudanças subsequentes no volume da célula foram usadas para calcular a P_f (cm / s). CEUA nº 7971160519. RESULTADOS: A análise de Western blot de amostras biotiniladas de oócitos controle não tiveram nenhum sinal detectável, enquanto as amostras de oócitos que expressam mUT-A2^WT, mUT-A3^WT e mUT-B^WT e seus respectivos mutantes revelaram bandas imunorreativas ao redor de 45 kDa. Este valor condiz com o peso molecular dos monômeros de UT glicosilados. Oócitos com expressão de mUT-A2^WT, mUT-A3^WT ou mUT B^WT tiveram valores de P_f significativamente (p>0,0125) maiores quando comparados com a dos oócitos que expressam seus respectivos mutantes ou dos oócitos controles. CONCLUSÃO: Assim, os resultados demonstram que os resíduos de T conservados no poro monomérico do mUT-A2, mUT-A3 e mUT-B são essenciais para o transporte de água pelos UTs. Nossa hipótese é que as hidroxilas presentes na cadeia lateral das T no poro monomérico interagem com as moléculas de água e ajudam a guiá-las através do poro. Portanto, os resultados deste estudo fornecem uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao transporte de água mediado pelos UTs e sugerem que o uso de inibidores de UT poderia funcionar como diuréticos eficazes, bloqueando tanto a ureia quanto o transporte de água.

   

• Palavras-chave
• Oócitos de Lithobates, Transporte de água, Filtro de seletividade, Transportadores de ureia
• Área Temática
• Fisiologia Renal