O vírus Rocio (ROCV, Orthoflavivirus ilheusense), um arbovírus da família Flaviviridae, apresenta semelhanças clínicas com outros arbovírus como o Zika, vírus do Nilo Ocidental e Dengue. Responsável em sua grande maioria por quadros autolimitados, em casos graves a infecção por ROCV pode resultar em complicações neurológicas como meningoencefalites. A grande maioria das infecções por ROCV é subdiagnosticada e compreender suas manifestações clínicas e os mecanismos moleculares de sua infecção são fundamentais para o desenvolvimento de estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento. Diante da escassez de informação sobre a biologia do vírus e ausência de ferramentas diagnósticas específicas, são necessários o avanço em estudos moleculares e bioquímicos. O genoma do ROCV é composto por uma fita simples de RNA com cerca de 11 kb, que codifica uma poliproteína precursora posteriormente clivada em três proteínas estruturais (envelope, pré-membrana e capsídeo) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). Enquanto as proteínas estruturais compõem a partícula viral madura, as proteínas não estruturais estão envolvidas na replicação do genoma viral, montagem do vírus, evasão das respostas imunes do hospedeiro e remodelação de membranas celulares. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto de iniciação científica é caracterizar as interações de proteínas não estruturais, principalmente a proteína não estrutural NS4A, de ROCV com proteínas de células hospedeiras. Entender estas interações pode contribuir para o entendimento sobre os mecanismos moleculares subjacentes à infecção por ROCV e oferecer insights significativos sobre a patogenicidade viral e a interação vírus-célula. Tais interações foram previamente mapeadas por imunoprecipitação e espectrometria de massas, técnica que permite a identificação de parceiros proteicos celulares associados às proteínas virais. Essas interações serão validadas utilizando técnicas de imunomarcação através de ensaios de ligação por proximidade (PLA), combinados à microscopia de fluorescência. Essa abordagem, sensível e específica, permitirá detectar interações proteína-proteína in situ. Células eucarióticas, especificamente HEK293T e hBMEC, serão cultivadas em meio DMEM completo e mantidas a 37 °C com 5% de CO?. Após atingirem confluência, essas células serão transfectadas com a sequência codificadora da proteína não estrutural do vírus ROCV, fixadas e permeabilizadas. Em seguida, serão incubadas com anticorpos primários específicos e submetidas ao protocolo do kit Duolink® para detecção dos sinais PLA. Os núcleos serão contra-corados com Hoechst 33342 e a visualização será realizada em sistema de imagem de alto rendimento, como o Operetta (PerkinElmer), com ampliação de 40x. A análise quantitativa e qualitativa será feita com o software Columbus ou equivalente. Através desta metodologia, será possível não somente validar estas interações com alta sensibilidade, assim como determinar a localização destas interações na célula. Espera-se, com isso, identificar pontos-chave da reorganização intracelular promovida pelo vírus, o que pode indicar mecanismos de evasão imunológica ou estratégias para replicação eficaz. Os resultados deste projeto contribuirão para melhorar a compreensão sobre os mecanismos de patogenicidade, incluindo como o ROCV manipula a maquinaria celular do hospedeiro durante a infecção, e fornecer insights sobre possíveis intervenções antivirais, sobretudo em um cenário em que o tratamento ainda é limitado ao manejo dos sintomas clínicos.
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Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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