Lilian Lee Depieri (IB-UNICAMP); Fabio Papes (IB-UNICAMP)
A Síndrome de Pitt-Hopkins (PTHS) é um tipo raro e monogênico de autismo causado pela haploinsuficiência do gene TCF4 em decorrência de mutações autossômicas dominantes de novo em um dos alelos do paciente. Os portadores dessa síndrome apresentam fenótipos característicos, como atraso motor profundo, ausência da fala e déficit cognitivo severo. Considerando que a proteína TCF4 atua como um fator de transcrição, entende-se que a haploinsuficiência do gene TCF4 afeta o funcionamento típico de outros genes-alvo. Logo, é importante estudar a desregulação da expressão gênica derivada da haploinsuficiência do TCF4, seja em termos de alterações nos níveis de expressão transcriptômica e proteômica, seja em termos de aberrações no processamento pós-transcricional de mRNAs.
Um mecanismo de processamento pós-transcricional é o splicing de RNAs, que é coordenado pelo spliceossomo e pode ocorrer de formas distintas dependendo do tipo celular ou tecido (splicing alternativo). Nosso time realizou experimentos de análise transcriptômica (sequenciamento de RNA bulk e single-cell), visando à identificação de genes com padrões aberrantes de splicing em células neurais derivadas de pacientes com PTHS. Dentre os genes analisados, destaca-se NRXN3, que codifica a proteína neurexina-3, a qual é uma molécula de adesão celular e está envolvida na formação de sinapses durante o neurodesenvolvimento. Nossas análises bioinformáticas preliminares indicaram a ocorrência de splicing alternativo aberrante em transcritos do gene NRXN3, especificamente do tipo exon skipping – um tipo de splicing em que certos transcritos não incluem um dos éxons do gene. Identificamos duas isoformas transcritas a partir de NRXN3, sendo uma delas predominantemente encontrada nas células de pacientes PTHS (transcrito A) e a outra encontrada majoritariamente nas células de indivíduos controles (transcrito B). Em relação às variantes proteicas codificadas pelas isoformas do gene NRXN3 analisadas, o transcrito A codifica uma neurexina-3 transmembrana e o transcrito B codifica uma neurexina-3 solúvel.
Este projeto de iniciação científica tem como objetivo verificar a ocorrência do perfil distinto de splicing no gene NRXN3 observado in silico. Para isso, primeiramente, foi realizado o cultivo de células neurais de pacientes PTHS e controle. Em seguida, foi realizada a extração do RNA total e a síntese de cDNA de cada linhagem celular cultivada. Por fim, foi iniciada a quantificação dos transcritos A e B através de experimentos de Real Time-qPCR, utilizando primers específicos para cada isoforma do gene NRXN3 sob investigação. Os experimentos de Real Time-qPCR estão sendo realizados para posterior análise e discussão dos resultados obtidos.
A alteração da proporção entre as variantes solúvel e transmembrana da proteína neurexina-3 é relatada na literatura em dois contextos patológicos distintos, a Doença de Alzheimer e a dependência de álcool. Em Hishimoto (2007), pacientes com vício em álcool apresentaram maior expressão do transcrito B em relação ao transcrito A, assim os autores do artigo sugeriram que a predominância da neurexina-3 solúvel está associada à perda de contato entre as sinapses e ao enfraquecimento das conexões sinápticas. Esta conclusão é complementar a de Hishimoto (2019), em que pacientes com a Doença de Alzheimer também apresentaram predominância do transcrito B, a partir deste resultado os autores associaram este cenário a menor liberação de neurotransmissores, ao acúmulo da proteína beta-amiloide e à disfunção da proteína APOE na degeneração sináptica. Assim, caso os resultados obtidos via sequenciamento de RNA bulk e single-cell sejam confirmados através dos experimentos de qPCR, é possível concluir que o transcrito A é predominante nas células PTHS e o transcrito B é predominante nas células controle. Este resultado será contrastante em relação às informações descritas para outras doenças psiquiátricas, como a Doença de Alzheimer. Desta forma, nossos resultados serão inéditos e permitirão uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares patológicos que diferenciam a Síndrome de Pitt-Hopkins de outras doenças neuropsiquiátricas.
Diante das informações descritas na literatura e os resultados esperados do projeto, entende-se que o estudo sobre o perfil de splicing aberrante do gene NRXN3 é de suma importância para a compreensão de disfunções no processo de sinaptogênese tanto no contexto da Síndrome de Pitt-Hopkins, quanto nas demais neuropatologias.
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