Integração de sinais ambientais e ativação do Sistema de Secreção do Tipo VI em Xanthomonas citri
Izabella Santos Mori Bragil1; Natália Carolina Drebes Dörr1; Cristina Elisa Alvarez Martinez1
1Departamento de Genética, Evolução, Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Brazil.
O sistema de secreção do tipo VI (T6SS) é uma estrutura multiproteica presente em muitas bactérias Gram-negativas, atuando como uma nanomáquina capaz de injetar efetores tóxicos diretamente em células-alvo, sejam elas eucarióticas ou bacterianas. Esse sistema desempenha papel central em interações interespecíficas, incluindo competição microbiana e resistência à predação protista. Em Xanthomonas citri, agente etiológico do cancro cítrico, o T6SS apresenta atividade anti-eucariótica, cuja função foi inicialmente descoberta por sua capacidade de conferir resistência contra a predação pelo protista Dictyostelium discoideum. O sistema é codificado por dois operons genômicos, cuja expressão é regulada por uma via de sinalização ainda não completamente compreendida. Evidências de estudos anteriores demonstraram que essa via de sinalização envolve a participação coordenada de uma quinase transmembrana sensora do tipo Ser/Thr (PknS) e de um fator sigma alternativo de função extracitoplasmática (EcfK) na ativação do sistema.
Estudos prévios propõem que, mediante a interação com organismos predadores, um sinal externo é propagado pelo periplasma bacteriano e ativa o domínio periplasmático de PknS, que promove sua autofosforilação no domínio quinase citoplasmático. Em seguida, PknS fosforila o fator sigma alternativo EcfK, induzindo sua associação ao núcleo da RNA polimerase, o que permite o direcionamento da holoenzima para promotores-alvo com sequência consenso reconhecida por EcfK. Dentre os genes regulados por EcfK, destaca-se tagK, que codifica um regulador transcricional da família AraC. TagK atua como o ativador direto da expressão coordenada dos genes estruturais e acessórios deste T6SS.
Apesar dos avanços já obtidos a respeito desta via de sinalização, o sinal ambiental que desencadeia a ativação de PknS permanece desconhecido. Para investigar esse ponto crucial, foram empregadas duas abordagens complementares. A primeira consistiu na expressão heteróloga e purificação do domínio periplasmático de PknS (PknS420-833), presumivelmente responsável pela percepção do sinal extracelular, visando à realização de estudos bioquímicos e estruturais. A segunda abordagem baseou-se na construção de uma linhagem repórter de X. citri contendo a região promotora de tagK fusionada ao operon luxCDABE, permitindo o monitoramento em tempo real de sua expressão gênica por meio da luminescência.
Ensaios de Differential Scanning Fluorimetry (DSF) com a proteína purificada permitiram a identificação de 151 compostos – incluindo pequenas moléculas orgânicas bioativas ou fragmentos químicos e compostos considerados aditivos químicos – que alteraram a estabilidade térmica do domínio periplasmático de PknS, reduzindo sua temperatura de desnaturação. Tais alterações sugerem interações específicas entre os compostos testados e a região sensora da proteína, tornando-os candidatos potenciais a ligantes do sistema. A identificação de tais ligantes é um passo crítico para o entendimento dos mecanismos moleculares de ativação do T6SS e para o desenvolvimento futuro de moduladores químicos com aplicação biotecnológica ou fitossanitária.
Em paralelo, os ensaios preliminares com a linhagem repórter revelaram aumento na atividade do promotor de tagK durante a co-incubação com a ameba D.discoideum, sugerindo que a via regulatória do T6SS é ativada em resposta à predação. No entanto, a superexpressão de EcfK — incluindo uma variante fosfomimética — não resultou em diferenças nos níveis de luminescência em comparação ao vetor vazio. Esses resultados indicam que, embora a fosforilação de EcfK seja necessária para a resposta completa, outros componentes ou mecanismos adicionais podem estar envolvidos na ativação do sistema em condições fisiológicas.
Coletivamente, os resultados obtidos até agora contribuem para o avanço no entendimento da regulação do T6SS em X. citri, reforçando a importância do domínio periplasmático de PknS na percepção de sinais ambientais e propondo novas hipóteses sobre a integração da resposta às condições do hospedeiro ou do ambiente.
Como próximos passos, serão realizadas abordagens voltadas à validação e caracterização das interações observadas nos ensaios de DSF. Inicialmente, realizaremos ensaios enzimáticos, como o ensaio de Ressonância Magnética Nuclear por Transferência de Saturação (STD-RMN), para confirmar a ligação direta entre os compostos selecionados e o domínio periplasmático de PknS420-833. Em seguida, utilizaremos a calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para quantificar a afinidade da ligação entre PknS420-833 e os compostos mais promissores. A ITC permitirá determinar parâmetros termodinâmicos da interação, fornecendo informações fundamentais sobre a estabilidade e o mecanismo de interação entre a proteína e os ligantes identificados. Por fim, será conduzido um ensaio de interação da proteína PknS420-833 com o extrato total de X. citri, com o objetivo de identificar possíveis parceiros moleculares endógenos. Além disso, continuaremos os ensaios com a linhagem repórter a fim de elucidar mecanismos adicionais que podem estar envolvidos na ativação e regulação do sistema.
Palavras-chave: Sistema de Secreção Tipo VI (T6SS); Xanthomonas citri; PknS (Ser/Thr quinase transmembrana); Regulação transcricional.
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