Segundo dados recentes da Organização Mundial da Saúde (OMS), as doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo. No Brasil, essa tendência se mantém e, como ocorre em diversos países, as doenças cardiovasculares são seguidas diretamente pelas neoplasias, segunda principal causa de mortalidade. Essas condições podem se tornar sinérgicas, visto que alguns quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer podem desencadear complicações cardiovasculares. Considerando que o câncer é, em muitos casos, uma doença curável, preservar a qualidade de vida dos pacientes a longo prazo torna-se uma preocupação emergente. A cardiotoxicidade induzida por fármacos é um dos principais desafios nesse contexto. Quimioterápicos amplamente utilizados, como a doxorrubicina (DOXO) e a cisplatina são capazes de induzir estresse genotóxico em células cardíacas, produzindo grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que causa danos no DNA, disfunção mitocondrial e sinalização citotóxica. Embora os mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos cardiotóxicos ainda não sejam totalmente compreendidos, estudos recentes demonstraram que a proteína quinase de adesão focal (FAK) desempenha um papel fundamental na sobrevivência celular durante o estresse genotóxico.
A FAK, também conhecida como proteína tirosina quinase 2 (PTK2), é uma quinase não receptora que se localiza nas adesões focais, citoplasma e núcleo. Em condições de estresse celular, FAK acumula-se no núcleo a fim de iniciar eventos de sinalização e regular a sobrevivência celular. No núcleo, a FAK possui uma função scaffold ligando-se a ubiquitina ligase Mdm2 e a proteína p53, para facilitar a ubiquitinação e degradação proteossomal de p53, favorecendo a sobrevivência celular. Recentemente, experimentos de co-imunoprecipitação seguidos de crosslinking e espectrometria de massas (XL / Ms/Ms), realizados por nosso grupo, demonstraram que FAK interage fisicamente com a porção RNF40 do heterodímero ubiquitina ligase RNF20/RNF40. Essa ubiquitina (Ub) ligase promove uma monoubiquitinação na lisina 120 da histona H2B (H2BK120ub) durante a resposta ao dano no DNA (DDR), evento essencial para recrutar a maquinaria de reparo para regiões de quebras no DNA. Essa modificação pós traducional (PTM) está associada ao alongamento da transcrição, mas também atua na ação de agentes genotóxicos, pois interfere na compactação da cromatina, diminuindo sua compactação, o que permite o acúmulo de proteínas de reparo ao dano no DNA nos locais de lesão, iniciando a DDR. O heterodímero ubiquitina ligase RNF40/RNF20 foi comprovado como essencial para a PTM H2BK120ub e como uma das funções da FAK é atuar como um scaffold ligando-se a ubiquina-ligases e aos alvos a serem ubiquitinados, propomos avaliar a importância funcional da interação entre FAK e a proteína RNF40 para a monoubiquitinação de H2B e, consequentemente, para o reparo ao dano ao DNA.
Objetivo geral: Investigar se a interação da quinase FAK com a ubiquitina ligase RNF40 impacta na ubiquitinação da lisina 120 da histona H2B (H2BK120ub) em cardiomiócitos submetidos ao estresse genotóxico.
Para isso, células da linhagem H9c2 foram expandidas e diferenciadas de cardiomioblastos em cardiomiócitos. Durante o cultivo, o meio de cultura teve o soro fetal bovino reduzido de 10% a 1% e foi acrescentado ácido retinóico na concentração de 1 umol L-1. As células foram mantidas em meio de diferenciação por 5 a 10 dias e, após a diferenciação, os cardiomiócitos receberam tratamentos pertinentes para a realização dos ensaios de Western blotting e microscopia de super-resolução por Iluminação Estruturada (SR-SIM), técnica utilizada para análises de colocalização e contagem dos sítios de quebra no DNA. Todos esses experimentos foram realizados em cardiomiócitos controle (CT) e tratados com doxorrubicina (1uM; 6h) ou com Cisplatina (10uM, 6h), conforme o objetivo.
Os dados obtidos demonstraram que a diferenciação dos cardiomioblastos foi realizada com sucesso. Para investigar a colocalização da FAK com RNF40 nos sítios de quebra no DNA (marcados por gamma-H2aX), foi realizada uma imunofluorescência combinada com SR-SIM em microscópio Elyra. As imagens obtidas foram analisadas no software ImageJ. A análise revelou uma maior colocalização de RNF40 com FAK no citoplasma e nas adesões/junções celulares em condições basais. Após o tratamento com cisplatina observou-se um aumento da colocalização nuclear entre essas duas proteínas. Esses dados sugerem que RNF40 é retida no citoplasma provavelmente via associação com FAK e desta com proteínas do citoesqueleto, em condições basais. Por outro lado, durante o estresse genotóxico, ocorre a importação nuclear e aumento da interação FAK-RNF40, indicando um possível mecanismo regulatório que atua durante a resposta ao dano no DNA. Análises futuras serão realizadas para confirmação dessas hipóteses.
Em seguida, células controle (Empty) e Knockdown de FAK (KD-FAK) foram utilizadas para verificação dos efeitos da redução da expressão de FAK nos níveis de ubiquitinação da lisina 120 da histona H2B. Experimentos de Western Blotting demonstraram que houve um silenciamento de aproximadamente 70% da expressão da FAK. Essa redução de expressão culminou em uma redução significativa da ubiquitinação da H2B em condições basais, já em condições de estresse genotóxico, desencadeado pela DOXO, foi observado uma tendência à redução dessa PTM em células KD-FAK (n=3 réplicas). Esses dados nos levam à conclusão de que a redução da expressão de FAK reduz a ubiquitinação de H2B, mostrando que a FAK é importante para essa PTM, a qual é um evento chave para atração das proteínas de reparo ao dano no DNA.
Em conclusão, os resultados analisados indicaram que a interação entre FAK e RNF40 é importante para a PTM H2BK120ub, visto que o Knockdown de FAK resultou na diminuição da H2BK120ub e as imagens de SR-SIM mostram uma maior colocalização nuclear de FAK e RNF40 em células sob estresse genotóxico. Futuramente, pretende-se explorar como a interação FAK-RNF40 e a adição H2BK120ub influenciam o reparo do DNA em cardiomiócitos sob estresse genotóxico. Este estudo poderá contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao dano no DNA, favorecendo a sobrevivência dos cardiomiócitos e a proteção cardíaca.
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Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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