Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são o grupo de tumores sólidos mais comum em pacientes pediátricos. A classificação molecular através da análise do metiloma desses tumores foi incorporada pela WHO (organização mundial de saúde) em 2021 por sua capacidade de fornecer informações precisas ao diagnóstico, garantindo um acompanhamento clínico adequado. Nas células cancerígenas, a telomerase permanece ativa, o que impede o encurtamento dos telômeros e permite replicações indefinidas e crescimento celular contínuo. Essa atividade depende de TERT, cuja expressão é regulada pela metilação da sua região promotora. Essa metilação é uma modificação epigenética que adiciona um grupo metil no carbono 5 da citosina em regiões CpG. Estudos identificaram hipermetilação do sítio CpG cg11625005 (chr5:1.295.737) no promotor de TERT em 72% dos tumores malignos, contra apenas 1% nos tumores de baixo grau e tecidos normais. A hipermetilação foi associada à pior sobrevida em casos de ependimomas. A qMSP (quantitative methylation-specific PCR) é uma técnica baseada na PCR que permite a detecção de padrões de metilação em ilhas CpG a partir de pequenas quantidades de DNA. Essa técnica baseia-se em dois procedimentos combinados, o tratamento com bissulfito de sódio e a amplificação por qPCR. A conversão por bissulfito modifica as citosinas não metiladas, convertendo-as em uracilas, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. A técnica de qPCR é empregada para quantificar a proporção de DNA metilado presente na amostra após tratamento com bissulfito. Durante a reação, as uracilas são amplificadas como timinas, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas e continuam a ser amplificadas como citosinas. A especificidade é garantida por primers e sondas que diferenciam DNA metilado do não metilado com base nas alterações provocadas pela conversão com bissulfito. Dessa forma, esse estudo possui como objetivo a padronização da qMSP para estabelecer um método de quantificação da hipermetilação do promotor do gene TERT como biomarcador em tumores pediátricos do sistema nervoso central. Primers foram desenhados especificamente para o gene TERT, região contendo o sítio CpG cg11625005, e para o gene de referência (?-actin) previamente convertidos por bissulfito, com o objetivo de evitar falso-positivos resultantes de conversão incompleta e garantir a discriminação entre sequências metiladas e não metiladas. A sequência genômica foi obtida no NCBI (NCBI Reference Sequence: NG_009265.1), e a seleção dos primers foi realizada utilizando a ferramenta MethPrimer, na opção “Pick MSP primers”. Os primers foram escolhidos com temperatura de melting (Tm) entre 57–60?°C, e com inclusão de pelo menos quatro citosinas não localizadas em dinucleotídeos CpG, para garantir máxima especificidade ao DNA convertido, e o tamanho final do produto amplificado varia entre 80 e 150 pb. Determinamos a temperatura de anelamento dos primers através da PCR convencional, testando as temperaturas 58ºC, 60ºC e 62ºC, determinadas pelas temperatura de melting indicadas para cada primer. Também foram testadas diferentes tampões para melhorar a eficiência da reação, como 10x PCR Buffer e p16 PCR Buffer (David Sidransky), ambos com maiores concentrações de cloreto de magnésio, além da adição de 1% de DMSO. Após essa padronização, iniciamos a qPCR utilizando o gene de referência ?-actin, com o objetivo de avaliar a faixa de detecção e gerar curvas de diluição para determinar sensibilidade, eficácia e reprodutibilidade da reação. Para a formação das curvas padrão, foi utilizado o corante ROX como referência. Inicialmente, empregou-se uma concentração de 1µL de ROX por 50µL de reação (diluição 50x, ou High ROX), sendo realizados dois testes em reações de 10µL no volume total, um com adição de 0,2µL por poço e outro com 0,02µL, ambos apresentando sinal de ROX mais elevado que o de HEX. Em seguida, o ROX foi diluído em 1:50, mas essa nova concentração apresentou-se inferior ao esperado. Após as tentativas anteriores, foi padronizado a concentração final de 0,1??L por 50??L de reação (fator de diluição 500x, ou Low ROX), de acordo com as especificações do equipamento QuantStudio 7. Foram realizadas diluições seriadas do DNA convertido (de 10ng a 0,001ng), mas não houve amplificação abaixo de 1 ng. Diante disso, novas faixas foram testadas: de 10 ng a 1,25ng e de 18ng a 0,6ng. Como resultados, tivemos a amplificação em ambos os tampões com os primers para região metilada, no p16 PCR Buffer observou-se amplificação nas temperaturas 60ºC e 62ºC, enquanto no 10x PCR Buffer houve amplificação nas três temperaturas testadas, porém apresentou uma banda mais nítida em 62ºC. Em primers para região não metilada, foi observado um melhor desempenho no 10x PCR Buffer, com amplificação em 60ºC e 62ºC, com uma banda mais definida a 62ºC. Em conjunto, a condição ideal dos primers para a reação foi alcançada com 6,7?mM de MgCl? (10x PCR Buffer) e temperatura de amplificação padronizada em 62?°C. A adição do corante de referência Low ROX, diluído em 1:10 para facilitar a pipetagem, na concentração de 0,3??L por poço em um volume total de 15??L de reação, foi adequada para o sistema utilizado, gerando uma curva adequada para análise. A curva de diluição gerada com as concentrações de 18?ng, 6?ng, 2?ng e 0,6?ng demonstrou que as concentrações de 1,25?ng e 0,6?ng não apresentaram amplificação, sendo 2?ng a menor quantidade de DNA com amplificação detectável. Dessa forma, foi possível a padronização da qMSP para análise da hipermetilação do sítio CpG cg11625005 no gene TERT. Outras padronizações estão em andamento para otimizar a reação e melhorar o limite de detecção dos primers.
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