Introdução: A família Orchidaceae é uma das maiores do reino vegetal, sendo amplamente distribuída. Como suas sementes possuem pouca reserva energética, a germinação depende de uma associação mutualística com fungos micorrízicos orquidóides, sendo uma relação bem estabelecida. Esses fungos penetram nas células das raízes da orquídea, formando estruturas chamadas pelotons – hifas emaranhadas – responsáveis pela troca de nutrientes entre os organismos. Dessa forma, o isolamento e cultivo desses fungos em laboratório são etapas fundamentais para estudos ecológicos, biotecnológicos e para o sucesso de estratégias de conservação, apesar dos desafios técnicos existentes. O isolamento dos pelotons é uma etapa fundamental para compreender a interação micorrízica em orquídeas, pois permite a identificação e cultivo dos fungos presentes nas espécies de orquídeas. No entanto, a obtenção de culturas puras desses microrganismos ainda representa um desafio, devido à dificuldade de manipulação dos pelotons e à presença de contaminantes. Apesar da importância reconhecida dessa interação, poucos estudos se dedicaram a comparar e otimizar sistematicamente os protocolos de isolamento de pelotons, visando aumentar a eficiência e reduzir a contaminação, o que representa uma lacuna significativa no campo. Embora existam essas dificuldades, o isolamento eficaz desses fungos é essencial para estudos moleculares, taxonômicos, ecológicos e para aplicações práticas, visto que muitas espécies de orquídeas estão ameaçadas de extinção, vulnerabilidade acentuada pela sua dependência com outros organismos, como os fungos micorrízicos, e pela pressão da ação humana. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo otimizar os métodos de isolamento e cultivo dos fungos micorrízicos presentes em pelotons de orquídeas, testando abordagens alternativas e avaliando suas limitações e potencialidades. Métodos: Para otimizar o isolamento e cultivo dos fungos micorrízicos associados às orquídeas, foram testados dois métodos distintos para obtenção e cultivo dos pelotons presentes nas raízes. Neste estudo, foram utilizadas exclusivamente orquídeas epífitas para a realização da metodologia. A espécie utilizada foi Vanilla sp., coletada em dois pontos na Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), em Feira de Santana, Bahia. As raízes foram previamente lavadas com água corrente para a remoção de resíduos. Após isso a desinfecção foi realizada com álcool 70% por 1 minuto, seguida de imersão em hipoclorito de sódio (NaClO) por 5 minutos, sendo em seguida as amostras enxaguadas com água destilada estéril. Posteriormente, com auxílio de lâminas de bisturi estéreis, foram feitos cortes transversais com aproximadamente 2mm cada. Utilizando um estereomicroscópio, os pelotons foram visualizados no córtex das raízes e retirados manualmente com o auxílio de agulhas de insulina estéreis. Os pelotons isolados foram transferidos diretamente para placas de Petri contendo meio batata dextrose ágar - BDA (Kasvi). Esse método visou garantir uma maior precisão na transferência, reduzindo assim o risco de contaminação da placa por outros microrganismos presentes no tecido vegetal. No segundo método, os cortes transversais das raízes esterilizadas foram diretamente colocados sobre a superfície do meio de cultura - BDA (batata-dextrose ágar), sem manipulação dos pelotons. A ideia foi permitir o crescimento espontâneo dos fungos a partir dos pelotons ainda inseridos nas células das raízes. As placas foram incubadas à temperatura ambiente (~25 ºC) por um período de até 20 dias. Sendo monitoradas diariamente para avaliar a taxa e velocidade de crescimento fúngico e a incidência e tipo de contaminações. Resultados: A comparação entre os dois métodos de isolamento testados evidenciou diferenças significativas quanto à eficiência do isolamento e à presença de contaminantes. No método 1, os pelotons foram retirados manualmente das células radiculares com auxílio de uma agulha de insulina, sob a lupa estereoscópica. Isso permitiu uma maior precisão na seleção do material inoculado, pois apenas estruturas com morfologia compatível com os pelotons foram transferidas para o meio de cultura. Essa seleção foi importante para minimizar a introdução de contaminantes, uma vez que evitou a transferência de regiões onde poderiam estar presentes microrganismos oportunistas não micorrízicos. Assim, ao focar exclusivamente nas estruturas de interesse, o método 1 proporcionou um ambiente mais controlado para o cultivo dos fungos simbiontes. No entanto, o procedimento foi tecnicamente desafiador. Os pelotons, por serem estruturas extremamente pequenas e frágeis, muitas vezes se desintegravam durante a manipulação, especialmente ao serem removidos da raiz ou ao serem transferidos para a placa de Petri. Como consequência, o número de pelotons viáveis que de fato chegaram ao meio de cultura foi reduzido, o que possivelmente refletiu na baixa taxa de crescimento fúngico nas placas. No método 1 foi observado um morfotipo fúngico por placa, refletindo a baixa taxa de sucesso no isolamento, possivelmente devido à inviabilidade dos pelotons manipulados. Em razão dessa limitação, foram realizadas apenas duas placas, ambas apresentando um único morfotipo fúngico. Evidenciando a necessidade de aperfeiçoamento técnico e de cuidados adicionais durante a manipulação. Já o método 2 consistiu na transferência direta de fragmentos radiculares contendo pelotons para o meio BDA, sem remoção prévia das estruturas simbióticas. Isso possibilitou um crescimento fúngico rápido, mas com elevada taxa de contaminação. Assim, fungos endofíticos contaminantes de crescimento rápido comprometem o isolamento seletivo, ocupando toda a superfície das placas, inviabilizando a observação e o isolamento dos fungos micorrízicos. Com isso, no método 2, o crescimento fúngico foi mais evidente, com ocorrência de 1 a 2 morfotipos distintos por placa, o que pode estar relacionado à maior taxa de contaminação por microrganismos oportunistas presentes nos fragmentos radiculares. Ao todo, foram obtidos 11 morfotipos distintos distribuídos em 8 placas de Petri, sendo que em cada placa foi inoculado um único fragmento radicular. Conclusão: O processo de otimização do isolamento de fungos micorrízicos está em andamento, e estes resultados iniciais destacam variáveis críticas, demonstrando a necessidade de ajustes nos protocolos para equilibrar eficácia de crescimento e controle de contaminação. Pesquisas futuras focarão na testagem de novos meios de cultura seletivos e no ajuste de variáveis físico-químicas, a fim de favorecer o crescimento seletivo dos fungos micorrízicos. Portanto, a médio e longo prazo, espera-se que os fungos isolados possam ser utilizados em ensaios de germinação simbiótica de sementes, programas de conservação de espécies nativas e em aplicações biotecnológicas, ampliando o conhecimento sobre a simbiose orquidácea e suas potencialidades ecológicas e econômicas.
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Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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