Resumo
A crescente utilização medicinal e recreativa de compostos derivados da Cannabis sativa, como ??-tetraidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD), tem gerado preocupações ecotoxicológicas devido à persistência desses compostos em ambientes aquáticos, além de potenciais riscos à saúde pública. O anfípode Parhyale hawaiensis destaca-se como modelo experimental alternativo para esses estudos, uma vez que análises genômicas não evidenciam a presença dos receptores canabinoides CB1 e CB2, principais mediadores do sistema endocanabinoide (SEC) em mamíferos. Essa característica permite investigar mecanismos de ação não mediados pelo SEC, como a interação desses compostos com a enzima acetilcolinesterase (AChE), além de refletir a suscetibilidade ecológica desse organismo. A hipótese central deste estudo considera que, na ausência dos receptores CB1 e CB2 em P. hawaiensis, compostos como THC e CBD poderiam exercer efeitos tóxicos por vias alternativas, incluindo a modulação da atividade da AChE.
Objetivos
Este trabalho teve como objetivos principais estabelecer P. hawaiensis como modelo experimental para estudos ecotoxicológicos de fitocanabinoides e determinar as concentrações letais médias (CL50 e CL20) de dois extratos de cannabis, além de avaliar possíveis efeitos enzimáticos indiretos, como a inibição da AChE.
Materiais e Métodos
Foram realizados três tipos de ensaios: ecotoxicológicos, enzimáticos e computacionais.
Ensaios ecotoxicológicos: Dois extratos de óleos canabinoides foram utilizados: extrato 1 (60 mg/mL de THC e 5,5 mg/mL de CBD) e extrato 2 (30 mg/mL de THC e 3,7 mg/mL de CBD). Juvenis de P. hawaiensis foram expostos a diferentes concentrações desses extratos em microplacas de 96 poços, com 10 animais por concentração, além de controles neutros e com solvente (acetona). Os ensaios duraram 48 horas, e a mortalidade foi analisada estatisticamente por meio do teste t de Student e do teste de Dunnett para comparação entre grupos.
Ensaios enzimáticos: A atividade da enzima AChE foi avaliada utilizando acetiltiocolina iodeto como substrato e o reagente cromogênico DTNB (Ellman’s reagent). A formação do produto TNB foi medida a 412 nm em espectrofotômetro. Ensaios foram conduzidos com extratos e compostos isolados, em concentrações elevadas (até 60 µg/mL), para verificar a ocorrência de inibição enzimática.
Ensaios computacionais: Estudos de ancoragem molecular (docking) foram realizados utilizando dados do Protein Data Bank (PDB) para a estrutura da AChE e do PubChem para as estruturas químicas dos compostos. Softwares como GOLD e Data Warrior foram utilizados para gerar conformações moleculares e prever interações de ligação entre os canabinoides e a enzima.
Resultados e Discussão
Os ensaios ecotoxicológicos indicaram toxicidade aguda apenas em concentrações muito superiores às detectadas em ambientes aquáticos reais, com CL50 de 24,49 µg/mL para o extrato 1 e CL20 de 6,13 µg/mL. Para o extrato 2, a CL20 foi de 19,17 µg/mL. Esses valores estão significativamente acima das concentrações ambientais relatadas, como 0,0002 µg/mL em rios africanos e 0,000016 µg/mL em efluentes tratados em Barcelona, sugerindo baixo risco letal direto para P. hawaiensis a curto prazo.
Entretanto, os ensaios enzimáticos demonstraram que o THC, em concentrações elevadas, inibiu significativamente a atividade da AChE. Essa inibição sugere que, mesmo que as concentrações ambientais sejam baixas, a exposição crônica ou a bioacumulação em ambientes de baixa renovação de água pode impactar processos fisiológicos importantes, como locomoção e comportamento alimentar, dependentes da neurotransmissão colinérgica.
Os estudos de ancoragem molecular confirmaram a interação do THC com regiões específicas da AChE, indicando um mecanismo de ação independente dos receptores canabinoides clássicos. Tais interações podem explicar, ao menos parcialmente, os efeitos tóxicos observados em altas concentrações e reforçam a hipótese de que vias alternativas, como a modulação enzimática, podem desempenhar papel relevante em organismos aquáticos expostos a esses compostos.
Conclusões
Os resultados obtidos reforçam a importância de P. hawaiensis como modelo experimental para estudos de ecotoxicidade de canabinoides, permitindo investigar efeitos não mediados pelos receptores CB1 e CB2. Apesar de as concentrações ambientais serem muito inferiores às que causaram efeitos agudos, a inibição significativa da AChE pelo THC em concentrações elevadas indica um possível mecanismo de toxicidade adicional. Essa descoberta amplia o entendimento sobre riscos potenciais de contaminação aquática por canabinoides e destaca a necessidade de investigações adicionais sobre bioacumulação, efeitos subletais e crônicos.
O trabalho também evidencia a utilidade da integração de ensaios ecotoxicológicos, enzimáticos e computacionais para elucidar mecanismos de ação complexos e subjacentes. A utilização de modelos como P. hawaiensis contribui para preencher lacunas sobre a toxicidade de compostos emergentes em ambientes aquáticos e subsidia estratégias para mitigação de impactos ambientais relacionados ao uso crescente de derivados da Cannabis sativa.
Comissão Organizadora
Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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