A vanilina é um aldeído aromático que confere o aroma característico da baunilha, sendo utilizado em diversos setores industriais, tais como o alimentício, cosmético e farmacêutico. Sua produção se dá majoritariamente por rotas petroquímicas, a partir do guaiacol, e sua extração de fontes naturais não é vantajosa do ponto de vista econômico e ambiental. Tal desvantagem motiva a busca de rotas biotecnológicas para sua produção a partir de moléculas de origem renovável, como o eugenol. O eugenol pode ser obtido por meio da despolimerização da lignina ou pela extração em escala industrial do óleo de cravo, se mostrando uma molécula promissora como matéria-prima renovável para a produção de biovanilina. A enzima CalB, de Pseudomonas sp., é uma aldeído desidrogenase que atua na via eugenol-a-vanilina na etapa de desidrogenação do coniferaldeído e já foi caracterizada funcionalmente. Nosso grupo descobriu uma nova coniferaldeído desidrogenase (MolB) de Xanthomonas citri, que, assim como a CalB, atua na desidrogenação do coniferaldeído na via. Ambas não possuem estrutura resolvida e baixa identidade de sequência com proteínas do PDB (Protein Data Bank). Deste modo, o objetivo desse estudo é elucidar a estrutura da MolB e compreender o papel de alguns aminoácidos presentes no sítio catalítico por meio de engenharia racional, visando otimizar sua aplicabilidade na via. Utilizando a enzima CalB como referência, duas mutações foram introduzidas no sítio ativo da MolB (R/L e E/G) por meio de mutagênese sítio-dirigida. Os genes mutantes foram clonados por PCR e confirmados por sequenciamento. Após confirmação das mutações, as variantes foram expressas em E.coli BL21 (DE3) ?SlyD pRARE II, a 20 °C, 16 h, 200 rpm e purificadas por cromatografia de afinidade a níquel seguida por cromatografia de exclusão molecular. Os impactos das mutações foram analisados quanto à estabilidade e a caracterização oligomérica por espalhamento dinâmico de luz (DLS), fluorimetria de varredura diferencial (DSF), dicroísmo circular (CD) e espalhamento múltiplo de luz acoplado à SEC (SEC-MALS). As cinéticas enzimáticas foram medidas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Em ensaios de DSF e CD, a mutante E/G demonstrou menor estabilidade (?Tm = -10 °C), ademais, os ensaios de atividade mostraram que a MolBE/G apresentou queda de 95% na atividade com o coniferaldeído. A mutante MolBR/L não apresentou alteração em sua estabilidade térmica. Análises cinéticas demonstraram que a mutante MolBR/L apresentou maior afinidade com o coniferaldeído e menor afinidade com a vanilina. Com o coniferaldeído, apresentou Km uma ordem de grandeza menor comparado à nativa e uma constante de especificidade (kcat/Km) 9 vezes maior. Já com a vanilina, apresentou uma constante de especificidade 3 vezes menor comparada à nativa. Ensaios de DLS e SEC-MALS indicam que em solução a MolB está em um equilíbrio oligomérico entre tetrâmeros, trímeros e monômeros. No entanto observou-se uma tendencia de dissociação de tetrâmeros para monômeros com aumento do pH 6 ao pH 8, sendo que para a enzima mutante R/L, apenas a espécie tetramérica foi observada em pH 6. Experimentos que buscam resolver a estrutura da enzima MolB estão em andamento com o objetivo de elucidar a relação estrutura-função da enzima e esclarecer de que maneira a mutação R/L impactou a afinidade da enzima pelo substrato. Até o momento, podemos concluir que a estratégia adotada foi eficaz em otimizar a aplicabilidade da enzima MolBR/L na via eugenol-a-vanilina.
Comissão Organizadora
Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
Em caso de dúvida, envie um email para contato@caeb.com.br
Ferramenta completa de submissão, avaliação e publicação de anais para eventos científicos.
