INTRODUÇÃO
Nanopartículas de sílica (SiO?-NPs) destacam-se em aplicações biológicas, devido às suas propriedades físico-químicas, como grande área superficial, biodegradabilidade, biocompatibilidade, tamanho e porosidade ajustáveis. O método de Stöber, pautado na hidrólise entre tetraetil ortossilicato (TEOS) e água, é usado para obter SiO?-NPs[1]. Por se tratar de uma reação lenta, utiliza-se amônia, catalisador que influencia no tamanho das partículas[2], que podem ser funcionalizadas com fluoresceína visando aplicações em marcação biológica[3].
Métodos biocompatíveis, responsivos, não invasivos e estáveis são essenciais para analisar atividades celulares. Assim, técnicas de imageamento pautadas em nanomateriais fluorescentes sobressaem-se, permitindo estudos em tempo real e de longa duração[3]. Invertebrados são frequentemente utilizados nessas análises, assumindo um papel importante em estudos ecológicos e como modelos biológicos, ao mesmo tempo que cumprem os requisitos éticos para se estudar organismos vivos. Destacam-se rotíferos, C. elegans e tardígrados como invertebrados com aplicações biológicas importantes, devido ao ciclo de vida, reprodução adequada e transparência de estruturas[4].
A marcação biológica é uma ferramenta relevante, visto que a coleta e observação de organismos microscópicos são difíceis. Obter imagens usando SiO?-NPs fluorescentes para análises de atividade sistêmica e celular é promissor, dadas à biocompatibilidade e à biodegradabilidade delas. Para avaliar a viabilidade do material é crucial a análise nanotoxicológica, que investiga efeitos toxicológicos dos nanomateriais considerando concentração, tempo de exposição e via de administração. As Daphnias são um modelo convencionado nesse meio, servindo como comparativo, dadas semelhanças perante rotíferos[3].
OBJETIVO
Tal estudo visa sintetizar SiO?-NPs fluorescentes para marcar modelos biológicos, avaliando toxicidade e efeito a longo prazo nos organismos.
METODOLOGIA
Síntese das SiO2NPs
Realizaram-se três sínteses pelo método de Stöber modificado, visando obter diferentes tamanhos de NPs. Portanto, variou-se as quantidades de água e NH4OH, utilizando-se 12,5 mL de etanol, 0, 50 e 100 ?L de água ultrapura, 500, 750 e 1000 ?L de NH4OH e 1 mL de TEOS, para as sínteses I, II e III, respectivamente. Posteriormente, as amostras foram agitadas em banho ultrassônico por 2 h, para subsequente lavagem.
Funcionalização
Visando atribuir fluorescência às partículas, utilizou-se duas estratégias: modificação de superfície e nucleação. A síntese I, material de menor tamanho, foi ressuspendida em etanol e submetida à modificação de superfície. Misturou-se 2 mL da amostra a 2 mL de etanol, ajustou-se o pH para 10, adicionou-se 80 µL de (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES-13 µL/mL) e, após uma hora, 10 µL de fluoresceína isotiocianato (FITC-0,05 mol/L), agitando o sistema por 1,5 h, antes de lavá-lo.
Na nucleação, adicionou-se 500 µL de FTIC (3 mmol/L) a 5 µL de APTES e 30 µL de KOH (1 mol/L), agitando o sistema por 1,5 h. Adicionou-se 500 µL dessa suspensão a 1 mL de TEOS, 12,5 mL de etanol e 0,5 mL de NH4OH, agitando por 2 h antes de lavá-la e levá-la ao microscópio de fluorescência. As funcionalizações ocorreram protegidas da luz devido à fotossensibilidade da fluoresceína.
Caracterizações e Avaliação de Nanotoxicidade
Os sistemas funcionalizados tiveram suas propriedades morfológicas e composicionais aferidas por caracterizações espectroscópicas e microscópicas. O ensaio nanotoxicológico deu-se em placas com meio de pH 7,4 e 5 Daphnias neonatas por poço, sendo 4 poços controle e 4 com SiO?-NPs nucleadas. Após 30 min, analisou-se um organismo no microscópio de fluorescência. A contagem de Daphnias sobreviventes foi feita após 72 h e novamente após 24 h.
Aplicação
Em 4 placas de petri, contendo 6 mL de meio com líquens retirados de casca de árvore, água e microrganismos, adicionou-se diferentes volumes de SiO?-NPs funcionalizadas (nada no controle, 150 µL nucleadas, 80 e 150 µL da modificada superficialmente). Em outra análise, adicionaram-se 100, 150, 200 e 300 µL das SiO?-NPs nucleadas em 2 mL de meio, depositando duas gotas na lamínula para análise no microscópio de fluorescência, visando observação da marcação nos organismos.
RESULTADOS
Medições por DLS indicaram possível aglomeração das nanopartículas, que apresentaram diâmetros superiores aos esperados pela literatura[4] (diâmetros das sínteses: I-140±10 nm, II-260±20 nm, III-760±50 nm). Análises no espectrofotômetro UV-Vis e espectrofluorímetro atestaram funcionalização adequada das amostras, denotando presença de fluoresceína, resultado amparado por avaliações da nucleada no XPS, haja vista ligações associadas ao FITC e ao APTES na superfície. Investigações realizadas por microscopia evidenciaram fluorescência mais evidente da amostra nucleada, com concentração de 30,6 g/L (via gravimetria). Consequentemente, focou-se em ensaios nanotoxicológicos desse sistema, aparentemente mais promissor para a aplicação proposta. Analisando a amostra nucleada no microscópio eletrônico de varredura (MEV), confirmou-se agregações de aproximadamente 500 nm.
O ensaio toxicológico com Daphnias spp mostrou marcação satisfatória 30 min após contato com o material, revelando ingestão dele, sem bioacumulação pela cadeia trófica e com baixa toxicidade nas primeiras 24 h. Contudo, houve alta mortalidade após 72 h, provavelmente pela agregação e instabilidade, dificultando a digestão, contribuindo para o estresse e comprometendo o movimento dos apêndices torácicos do animal, prejudicando sua locomoção. Apesar disso, a sobrevivência de parte dos organismos demonstra potencial de uso.
Aplicações realizadas no microscópio de fluorescência demonstraram que a amostra nucleada apresentou marcação mais evidente que a modificada superficialmente, evidenciando-se marcação de C. elegans e rotíferos. Encontrou-se tardígrados vivos em contato com o coloide, denotando baixo estresse ambiental, pois, em alteração expressiva, estariam em estado criptobiótico, impedindo a observação. Assim, evidenciou-se biocompatibilidade coerente com as análises nanotoxicológicas, bem como potencial para marcação biológica.
CONCLUSÕES
Conclui-se que SiO?-NPs funcionalizadas por nucleação são aplicáveis na marcação de microrganismos. Apesar do tamanho maior que o esperado, as SiO?-NPs apresentaram biocompatibilidade, potencial baixa toxicidade e fluorescência evidenciando funcionalização efetiva. Ademais, apresentaram instabilidade por aglomeração, mas sem floculações visíveis. Análises de nanotoxicidade indicaram ausência de bioacumulação nos organismos, biocompatibilidade parcial, baixo estresse ambiental a curto prazo, mas relativa toxicidade a longo prazo. Foi possível atingir resultados satisfatórios nas aplicações, atestando a viabilidade de SiO?-NPs fluorescentes para a marcação biológica de microrganismos, com potencial para estudos ecológicos e farmacológicos.
REFERÊNCIAS
[1]Stöber,W.,Fink,A. & Bohn,E.Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range.J.ColloidInterfaceSci.26,62–69(1968).
[2]Costa,C.A.R.,Leite,C.A.P. & Galembeck,F.Size Dependence of Stöber Silica Nanoparticle Microchemistry.J.Phys.Chem.B107,4747–4755(2003).
[3]Wang,K.,He,X.,Yang,X. & Shi,H.Functionalized silica nanoparticles: a platform for fluorescence imaging at the cell and small animal levels.Acc.Chem.Res.46,1367–1376(2013).
[4]Dahms,H.-U.,Hagiwara,A. & Lee,J.-S.Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers.Aquat.Toxicol.101,1–12(2011).
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