Introdução: O cultivo de células 2D vem sendo aperfeiçoado ao longo de um século, e apesar de ser barato, simples, bem estabelecido e menos sensível a manipulações de operadores, apresenta limitações, especialmente referente à reprodução do ambiente in vivo. Para contornar esse obstáculo, surge o modelo de cultivo de células 3D, dentre os quais destacam-se os esferoides. O desenvolvimento dos esferoides possibilita a replicação de características complexas comuns ao meio biológico investigado, como o gradiente de transporte de substâncias no organismo. Além disso, esse modelo celular pode ser cultivado pelo método convencional (por exemplo, placa de 96 poços de baixa aderência) e em chips. Entretanto, a primeira abordagem oferece um baixo rendimento e heterogeneidade nos tamanhos de esferoides, o que afeta diretamente a reprodutibilidade¹. Dessa forma, o método escolhido para o projeto foi o cultivo celular em chips. Com isso, é possível obter uma alta eficiência e maior controle dos tamanhos dos esferoides. Ainda nesse contexto, o uso da microfluídica é capaz de mimetizar a passagem de fluxo que ocorre in vivo. Apesar de ser uma alternativa promissora, essa plataforma ainda carece de maiores estudos, uma vez que o chip de polidimetilsiloxano (PDMS) convencional é geralmente ligado irreversivelmente ao substrato, dificultando a extração eficiente de células viáveis para manipulação posterior. Logo, é fundamental garantir a reversibilidade na selagem do chip. As técnicas atuais de selagem reversível limitam os materiais que podem ser utilizados e possuem um processo de fabricação complexo².
Objetivo: Considerando os pontos levantados acima, o presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um chip de PDMS com selagem reversível, o qual visa o cultivo de esferoides que mimetizam os ambientes estudados, tornando o experimento mais semelhante ao observado in vivo e possibilitando a extração simplificada das células para a caracterização.
Métodos: Inicialmente, foram preparados dois formatos de molde dos chips que seriam testados, sendo um com poço quadrado e outro com poço de angulatura suave. Para tanto, preparou-se o material composto por PDMS e um elemento de cura, relevante para o endurecimento da mistura. Após misturar ambos os compostos em uma razão de 10 para 1 e depositar nos moldes, o conjunto foi levado a estufa por 1h a 65° C.
A linhagem de células utilizada foi a MDA-MB-231 (célula de câncer de mama), a qual foi cultivada em meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (10.000 U mL?¹ de penicilina potássica, 10.000 ?g mL?¹ de estreptomicina). A placa foi mantida em incubadora a 37°C.
As concentrações e células no chip para formação dos esferoides variaram de 10.000-200.000 células por canal, as quais foram deixadas em cultivo por 3 dias.
Por meio de medidas eletroquímicas, voltadas para o estabelecimento do volume necessário para troca completa de meio do canal, foi adicionado 25 microlitros de solução de sonda no canal e então quantificado a percepção de corrente após repetitivas adições de eletrólito.
Resultados e discussão: Um aspecto fundamental durante os testes do projeto envolvia o preenchimento eficiente dos canais do chip de PDMS fabricado. Contudo, observou-se o problema de formação de bolhas nos poços que serviriam como região de permanência dos esteroides da célula. Visando a solução desse impasse, foi introduzido um material que possuísse maior molhabilidade do que a água/meio de cultura antes da adição das células, como o isopropanol/etanol. Dessa maneira, o resultado obtido foi satisfatório, sendo possível preencher posteriormente o canal com água/meio de cultura sem a formação de bolhas nos poços.
Outro aspecto de grande relevância foi o volume necessário de solução para trocar completamente o meio, isto é, limpar o canal para aplicação de um novo composto. Essa prática foi concretizada por meio da realização de medidas eletroquímicas voltadas para o desempenho dos eletrodos, verificando a diferença de captação de sinais elétricos para cada volume de solução envolvida. Foi alternado o uso de sonda e eletrólito para atingir o resultado visado. Concluiu-se que a realização de 5 lavagens foi suficiente para a troca integral de meio. Com relação à selagem reversível, essa se mostrou eficaz, pois passou pelo teste de bomba. Já com relação aos canais, os testes eletroquímicos mostraram que uso de cinco vezes o volume desses viabiliza troca completa dos reagentes.?
Em relação à cultura de células, antes de introduzir a solução com material celular nos poços foi adicionado o BSA (Albumina de soro bovina) para que a aderência das células ao canal e poço fosse evitada. As células foram adicionadas nos canais em diversas concentrações, sendo a quantia de 150.000 células por canal a quantidade escolhida para formação de esferoides de 600 mm, tamanho ideal para posterior ensaio de susceptibilidade a fármacos.
Em seguida, no momento de testar a permanência dos esferoides dentro do poço, apenas no de formato mais quadrado foi observada a conservação de seu estado, enquanto no de angulatura suave ocorria a remoção da célula 3D com o fluxo introduzido no canal. Portanto, o chip que apresentava desempenho adequado para ser selecionado para o projeto foi o quadrado.
Conclusão: Conclui-se que os resultados evidenciados no decorrer do projeto revelam que o trabalho, ao utilizar de técnicas de cultivo de esferoídes, de uso de microfluídica e selagem reversível, representa um grande avanço para a realização de experimentos possuem o intuito de analisar fenômenos cada vez mais semelhantes ao cenário in vivo referente.
Referências:
[1] Tevlek, Atakan, et al. ACS Omega, vol. 8, n.o?4, janeiro de 2023, pp. 3630–49.?DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1021/acsomega.2c06052.
[2] Feng, Xiaohan, et al. Lab on a Chip, vol. 24, n.o?14, julho de 2024, pp. 3546–55.?pubs.rsc.org, https://doi.org/10.1039/D3LC01019H.
Comissão Organizadora
Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
Em caso de dúvida, envie um email para contato@caeb.com.br
Ferramenta completa de submissão, avaliação e publicação de anais para eventos científicos.
