Introdução
O PD-1 é um receptor responsável por atenuar o sinal apoptótico nos linfócitos T ao ser ativado por seus ligantes, as proteínas PD-L1 e PD-L2. Sendo que o ligante PD-L1 pode ser super expresso na superfície de tumores, ligando-se ao PD-1 e permitindo a indução da tolerância imune.¹
Dessa forma, o anticorpo monoclonal anti PD-1 Nivolumab é amplamente utilizado no tratamento de alguns tipos de câncer, como o tipo renal metastático. Ele atua a partir da inibição dos checkpoints imunológicos, bloqueando as interações entre o PD-1 e seus ligantes. O Nivolumab se liga ao loop N-terminal do PD-1, sendo essa uma região flexível que é observada por cristalografia exclusivamente quando ocorre sua estabilização pela ligação com o Nivolumab.¹
A dinâmica molecular é uma técnica de simulação computacional usada para avaliar o comportamento dinâmico de sistemas moleculares. Para isso, são usadas as leis da física clássica para conseguir simular a evolução temporal das estruturas. Essa técnica possui diversas aplicações, como desenvolvimento e caracterização de biomoléculas, fármacos e materiais. Atualmente, as simulações de dinâmica molecular são o estado-da-arte no estudo do comportamento de regiões intrinsicamente desordenadas de proteínas, como é o caso do loop N-terminal do PD-1.²
Objetivo
O objetivo deste trabalho é comparar dois campos de forças (AMBER03* e AMBER03ws) quanto à sua capacidade de modelar adequadamente o comportamento dinâmico do loop N-terminal flexível do PD-1.
Métodos
A estrutura do PD-1 usada neste trabalho foi extraída do PDB ID 5WT9. As simulações de dinâmica molecular foram feitas com o software GROMACS, e o PD-1 foi simulado em duas condições: usando os campos de forças AMBER03* e o AMBER03ws. Considerou-se três réplicas de 200ns para cada sistema, sendo que em todos os casos as seguintes condições foram modeladas como ambiente fisiológico: pH 7, força iônica de 150mM, temperatura de 36ºC e pressão de 1 atm.
Resultados e Discussão
Após a reconstrução de regiões não visíveis na estrutura cristalográfica com a plataforma RCD+, foi utilizado o software GROMACS para as etapas de simulação. Inicialmente a estrutura em formato PDB foi convertida para o formato GRO, gerando também o arquivo de topologia. Em seguida, foi definida a caixa de simulação, onde foram testadas as geometrias cúbica e dodecaédrica, variando também a presença e ausência da flag “princ” que orienta as moléculas ao longo do eixo principal da caixa.
A partir dos testes, foi selecionada a caixa dodecaédrica para realizar as etapas da simulação devido à redução de 33.683 para 23.311 moléculas de água. Dessa forma, atendendo dois focos: a de reduzir o número de moléculas simuladas, para diminuição do custo computacional, assim como respeitar as condições periódicas de contorno. Para uma economia um pouco maior, também se utilizou a flag “princ” que a partir da orientação reduziu mais a quantidade de moléculas de solvente.
Após definir da geometria, realizou a neutralização da carga da proteína e a modelagem do ambiente fisiológico (concentração iônica de 150 mM) por meio da adição de íons sódio (comum no ambiente extracelular) e cloreto (carga negativa padrão presente na solução fisiológica).
Uma vez realizada a montagem do sistema, é iniciado o processo de minimização, em que ocorre convergência para o estado de menor energia local do sistema. A etapa seguinte é a equilibração, na qual foi aplicada a distribuição de Maxwell-Boltzman para amostrar as velocidades iniciais dos átomos do sistema considerando a temperatura de 309 K (36ºC). Nessa etapa o solvente foi simulado por 1 ns, enquanto a proteína foi mantida imóvel. Assim, foram criadas três réplicas da simulação a partir de diferentes sementes aleatórias, gerando diferentes velocidades iniciais para os átomos. Por fim, executou-se a etapa de produção por 200 ns para cada uma das réplicas.
Como empregou-se diferentes sementes na amostragem das velocidades iniciais para as três replicatas, cada uma gerou diferentes trajetórias para proteína. O que se observou na simulação da estrutura do PD-1 com o campo de forças tradicional (AMBER03*) foi a compactação da extremidade N-terminal sobre o restante da estrutura. Apesar de ainda ser possível observar certa flexibilidade nesta região, como observado pelo RMSF (medida de flexibilidade estrutural), o loop N-terminal ficou ligado ao restante da cadeia proteica com movimento reduzido.
Em comparação ao observado nos dados experimentais do PD-1 (PDB ID: 6UMU), era esperado que a estrutura terminal fosse uma região flexível, visto que não é possível visualizá-la nas estruturas cristalográficas do PD-1 obtidas na ausência do Nivolumab. Sendo assim, visualizou-se uma redução da flexibilidade real da proteína nas três trajetórias geradas pelo campo de força tradicional.
Por outro lado, o campo de forças modificado (AMBER03ws) reproduziu adequadamente a flexibilidade do loop N-terminal conforme esperado com base nos dados experimentais. Este campo de forças utiliza moléculas de água de quatro pontos (TIP4P) com intensidade da interação com a proteína aumentada em 10% em relação ao campo de forças tradicional, o que dribla um problema comum nas simulações, que é a presença de proteínas excessivamente compactadas por serem insuficientemente solvatadas. Como foi possível observar no RMSF das três trajetórias, o loop N-terminal não ficou compactado com o restante da estrutura da proteína PD-1 e teve liberdade de movimento.
Conclusão
Em conclusão, obteve-se uma redução do custo computacional a partir da escolha do formato da caixa dodecaédrico e de ajuste da orientação da proteína. Obteve-se, diferentes trajetórias a partir do uso de diferentes sementes aleatórias na etapa de equilibração. Essas permitiram avaliar que o campo de forças modificado (AMBER03ws) produziu simulações mais acuradas, sendo possível a visualização da flexibilidade da alça terminal do PD-1, o que era esperado conforme os dados experimentais. Sendo assim, validou-se o campo de forças modificado AMBER03ws como uma ferramenta adequada para a modelagem do PD-1 e para uso em futuros estudos da sua interação com outras proteínas, como o próprio Nivolumab e outros anticorpos monoclonais.
Referências
1. Tan, S. et al. An unexpected N-terminal loop in PD-1 dominates binding by nivolumab. Nat. Commun. 8, 14369 (2017).
2. Balanced Protein–Water Interactions Improve Properties of Disordered Proteins and Non-Specific Protein Association | Journal of Chemical Theory and Computation. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ct500569b.
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