Afiliações: FAPESP, Laboratório de Genômica e BioEnergia (LGE) e UNICAMP.
Atualmente, devido ao aumento populacional nas últimas décadas, urge a necessidade de otimizar a geração de produtos para suprir demandas dessa população em crescente desenvolvimento. Em paralelo, é necessária a criação de tecnologias que diminuam os impactos ambientais gerados por esta produção intensa e de larga escala. Nesse sentido, as enzimas, moléculas que atuam como catalisadoras de reações, são fundamentais. Na produção de biocombustíveis, por exemplo, estudos envolvendo a xilose-isomerase destacam seu papel essencial na conversão da xilose em xilulose fermentável para a geração de etanol de segunda geração. Com o foco em aprimorar aspectos como seletividade, especificidade ao substrato e atividade dessas enzimas, a evolução dirigida é amplamente empregada para indução de mudanças genéticas aleatórias na cadeia primária de proteínas. Dessa forma, a variedade gênica irá refletir em diferentes fenótipos que podem ser ótimos em condições de cultivo de interesse. O conjunto de todas as variantes geradas é chamado de biblioteca gênica, a qual pode conter milhares de variantes. Se levado em conta Saccharomyces cerevisiae, sua proteína média é composta por cerca de 379 aminoácidos, em termos de variabilidade teórica, cada posição nessa sequência pode ser ocupada por qualquer um dos 20 aminoácidos naturais, gerando um número de possibilidades muito alto, tornando um desafio a análise e seleção de mutações benéficas. Nesse sentido, atuais sistemas high-throughput, como a microfluídica — técnica de compartimentalização de células individuais em gotas através de uma emulsão água-óleo — apresentam eficiência na escala de até 103-4 variantes, considerado baixo. Ademais, tais sistemas apresentam limitações técnicas associadas ao alto custo de fabricação e compra de equipamentos especializados, além da necessidade de pessoal treinado para manipulação e uso dos mesmos. Tendo em vista estes pontos, este projeto busca desenvolver uma nova ferramenta de seleção de alto rendimento baseado na capacidade de reprodução de uma célula em um meio onde as variantes testadas estão correlacionadas ao fitness celular. Para tal, o sistema de escolha é a levedura Saccharomyces cerevisiae, e o marcador genético de proliferação é a histona H2A (HTA2) — proteína com alta abundância intracelular, alta taxa de meia-vida, e que apresenta um padrão de segregação igualitária entre as células filhas. O mecanismo de rastreamento das variantes otimizadas — e que, portanto, induziriam maior sucesso reprodutivo das células hospedeiras — é baseado em um gene repórter fluorescente fotoconversível fusionado à H2A: inicialmente, a população modificada seria exposta a um comprimento de onda que faz a conversão irreversível da fluorescência, enquanto as células-filha sintetizam novos genes repórter de coloração original. Assim, variantes que conferem vantagem ao fitness celular seriam selecionadas pela emissão de fluorescência mais intensa da cor original do gene repórter. Desta forma, se espera que a triagem seja reduzida à escala de uma única célula que, acoplada a análise por citometria de fluxo, permite altas taxas de rendimento, facilitando a manipulação de bibliotecas genéticas e a seleção de fenótipos com variantes de interesse. Foram utilizadas a cepa BY4741 de S. cerevisiae e a proteína fluorescente fotoconversível mEos3.2 — que inicialmente emite fluorescência verde. Para isso, foi montado um cassete com regiões de homologia para integração genômica do repórter no locus HTA2, o qual foi inserido no p426GPD. Para propagação do plasmídeo, foi utilizada a bactéria Escherichia coli DH10-Beta. Posteriormente, foi feito o knock-in no locus HTA2 através de recombinação homóloga, com utilização do sistema CRISPR/Cas9. Assim, colônias positivas foram selecionadas, sequenciadas pelo método Sanger e testadas quanto à fotoconversão. Foi utilizado microscópio confocal para tal e, quando submetidas a um pulso no comprimento de onda de 405 nm por 10 segundos, as proteínas mudaram sua coloração verde para vermelho, evidenciando o sucesso da integração. Atualmente, estão sendo realizadas análises para verificar a variação desse sinal ao longo das divisões celulares. Portanto, o intenso sinal vermelho após a fotoconversão tende a decair conforme as células forem proliferando, e o verde consequentemente a aumentar. Posteriormente, será feita a transformação da cepa repórter LEU- com o plasmídeo controle p426 e o plasmídeo p426-LEU2, que carrega o gene de síntese de leucina. As cepas transformadas serão cultivadas em meio seletivo, e suas taxas de crescimento comparadas por meio de citometria de fluxo e absorbância.
Comissão Organizadora
Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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