BMP (Bone Morphogenetic Protein) e seu homólogo Decapentaplegic (Dpp), em Drosophila melanogaster, são morfógenos envolvidos em sinalização parácrina durante o desenvolvimento, na homeostase e na progressão de diversas doenças, incluindo o câncer. Esse tipo de sinalização é mediada por contato celular e citonemas (filopódios especializados em sinalização) e se assemelha a sinalização neuronal. No entanto, os achados até agora não evidenciaram um acúmulo de vesículas “pré-sinápticas” contendo morfógenos de sinalização parácrina nos citonemas de células não neuronais. Por isso, nesse projeto, visamos caracterizar in vitro a rota biossintética de Dpp, ao nível celular e subcelular, e in vivo o padrão de exportação e sinalização do mesmo morfógeno, a nível tecidual. Para isso, utilizaremos a estratégia de split-GFP, que consta da expressão condicional de dois componentes do split-GFP: (1) Proteína localizadora fusionada com GFP1-10 e (2) Dpp fusionado com GFP11(7x). O GFP, quando reconstituído, permitirá a inferência sobre o processo de exportação ou transferência do Dpp de acordo com o local de expressão da proteína localizadora fusionada com GFP1-10. Ademais, para a realização das análises in vivo serão cruzados indivíduos transgênicos do organismo modelo Drosophila melanogaster, os quais possuem genes repórteres capazes de proporcionar a observação dos padrões de exportação e transferência de Decapentaplegic para células vizinhas. Os organismos serão então mantidos em estoques no laboratório (em vials de vidro com alimentação) para que possam ser escolhidos e utilizados nos cruzamentos diferenciais, envolvendo a seleção de fêmeas virgens e transferência dessas para novo vial de vidro (juntamente com os machos dos estoques drivers de interesse) de modo a garantir o genótipo da prole. Esses cruzamentos consistem em indivíduos do genótipo btlGal4,DppLHG/cyo,wp que serão cruzados com indivíduos do genótipo sco/cyo,wp;UAS-CD4:GFP1-10,LexOp-Dpp:GFP11/TM6B para que sejam geradas larvas no estágio L3 de desenvolvimento. E a seleção da prole baseia-se em escolher aqueles que apresentam ausência dos marcadores balanceadores como o cyo,wp do segundo cromossomo, que faz os indivíduos que o possuem apresentarem asas curvadas quando adultos e larvas as quais todas as células emitem fluorescência GFP, e o TM6B do terceiro cromossomo, que faz com que as larvas apresentem corpo reduzido e mais largo. A seleção resultará no genótipo btl-GAL4,DppLHG/sco;+/UAS-CD4:GFP1-10, LexOp-Dpp:GFP11. Nesse indivíduo, a proteína transmembrana CD4 com GFP1-10 extracelular (CD4:GFP1-10) será expresso no tecido traqueal ligado ao disco imaginário da asa (regulado pelo driver btl-GAL4), tornando essas células potencialmente fluorescentes caso o GFP seja reconstituído pela entrega do morfógeno. E o Dpp:GFP11 será expresso em outra região do disco (regulado pelo driver Dpp-LHG), o que fará com que o Decapentaplegic seja superexpresso na célula em que ele é endogenamente produzido. Poderemos então, a partir da dissecção das larvas L3 obtidas e através da microscopia confocal, observar com detalhamento subcelular a transferência do Dpp de uma célula para outra e interpretar esses resultados também a nível tecidual. Já na etapa in vitro do projeto serão utilizadas técnicas de design de plasmídeos (de expressão dos morfógenos e outros de expressão de GFP1-10 - proteínas localizadoras) e técnicas de co-transfecção, as quais possibilitarão a localização específica do Dpp na via biossintética a partir da análise de imagens confocais das células S2 (Schneider 2) de Drosophila. O presente trabalho se encontra em estágios iniciais de desenvolvimento, mas espera-se que o resultado desses experimentos permitam, pela primeira vez, caracterizar o padrão de exportação de Decapentaplegic no nível celular e tecidual, além de trazer mais informações sobre a exportação do morfógeno por meio do entendimento da sua via biossintética. Por fim, as caracterizações in vitro e in vivo do projeto serão instrumentais para avançar nos estudos de regulação da sinalização parácrina mediada por Dpp e regulada por proteoglicanos de heparam sulfato, a qual esse projeto de iniciação científica está inserido.
Comissão Organizadora
Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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