A produção global de plástico tem aumentado de forma significativa ao longo das décadas, devido a suas inúmeras aplicações para a sociedade. Micro e nanoplásticos (MNPs), produzidos intencionalmente ou resultantes da degradação de resíduos plásticos, já são encontrados no ar, na água e em diversos alimentos, sendo o poliestireno (PS) um dos mais comuns. Além disso, diversos estudos já comprovaram a presença sistêmica dessas partículas no corpo humano, levantando preocupações quanto aos impactos deste material na saúde. No entanto, os mecanismos celulares subjacentes aos efeitos desses materiais ainda são pouco compreendidos. Este trabalho tem como objetivo comparar os efeitos fenotípicos induzidos por nanoplásticos de poliestireno (NP-PS) em células Huh7 com aqueles provocados por inibidores de vias de sinalização celular específicas, buscando inferir vias possivelmente moduladas pelo plástico com base em similaridades fenotípicas. Neste resumo, apresentamos os resultados parciais correspondentes à etapa de caracterização fenotípica induzida pelos inibidores, que servirá como base comparativa para as análises futuras com os plásticos.
Para isso, foi realizada a caracterização físico-química das NP-PS utilizadas no estudo por meio de espalhamento dinâmico de luz (DLS). A solução estoque das nanopartículas de plástico (1g/L) foi diluída 1:10 em água ultrapura ou em meio DMEM suplementado (10% de soro fetal bovino), sendo analisadas quanto ao tamanho hidrodinâmico, índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta nos tempos 0 h e 24 h. Em seguida as células Huh7 foram expostas a cinco inibidores de diferentes vias de sinalização: KU-0063794 (via mTOR), LY-2109761 e SIS3 (via TGF-beta, atuando em pontos upstream e downstream, respectivamente), Q-VD-OPh (inibidor de apoptose) e Bafilomicina A1 (inibidor de função lisossomal). A viabilidade celular foi avaliada após 24h de tratamento, por ensaio de MTT. As concentrações testadas foram selecionadas com base na literatura para garantir ampla faixa de resposta e posterior escolha de dose subletal (~80% de viabilidade).
Os resultados da caracterização físico-química das NP-PS demonstraram que as nanopartículas de plástico possuem maior estabilidade coloidal em água do que em meio suplementado. Em água, o diâmetro hidrodinâmico médio das nanopartículas não se altera após 24h de incubação (estufa de atmosfera umidificada, a 5% de CO2 e 37ºC), mantendo-se em 71 nm. Além disso, o potencial zeta (um importante indicador da estabilidade de nanopartículas) das NP-PS varia de -35mV (SD = 1,12) a -46mV (SD = 0,68) após 24 de incubação (P = 0,0001), indicando alta estabilidade da suspensão das nanopartículas de plástico em água. No entanto, em meio suplementado observou-se o aumento do tamanho médio das nanopartículas, inicialmente em 382 nm para 499 nm após 24h de incubação, e redução do potencial zeta das NP-PS, variando de -10,5mV (SD = 0,89) para -13mV (SD = 0,85) em 24h (P = 0,0294), sugerindo agregação e menor estabilidade coloidal.
O ensaio de redução do MTT indica uma redução progressiva da viabilidade celular com o aumento da concentração para os inibidores KU-0063794, LY-2109761, SIS3 e Q-VD-OPh., enquanto a Bafilomicina A1 não apresenta esse padrão. Apesar destes padrões, o teste Ordinary one-way ANOVA Multiple Comparisons aponta diferença estatística (nível de significância P <= 0.05) apenas para composto KU-0063794, na maior concentração testada (6?M), em relação ao controle não-tratado. Este resultado nos permitiu determinar a concentração que mantêm a viabilidade celular acima de 80%, possibilitando uma análise de alterações fenotípicas sem interferência de morte celular acentuada. Estas concentrações serão utilizadas para a realização da próxima etapa do projeto que envolvem a comparação dos perfis fenotípicos das células expostas aos inibidores e à NP-PS, uma vez que estudos anteriores do grupo já demonstraram que a exposição de células Huh7 a diferentes concentrações de plástico não leva a morte celular, mas sim a alterações fenotípicas sutis e subletais.
Esses resultados demonstram que o comportamento físico-químico das NP-PS varia significativamente com o meio em que estão inseridas. A maior estabilidade observada em água sugere que, isoladamente, essas partículas tendem a se manter bem dispersas. No entanto, a perda de estabilidade em meio suplementado aponta para a formação de agregados entre si ou mesmo a interação das NP-PS com os sais e proteínas do meio, fenômenos que podem alterar a biodisponibilidade e a internalização celular das NP-PS. Por outro lado, a determinação das concentrações de inibidores permite investigar alterações fenotípicas em condições não citotóxicas, isolando o efeito sobre vias de sinalização específicas. A baixa citotoxicidade dos inibidores em doses moderadas reforça a adequação desse modelo para comparação com os efeitos dos plásticos, favorecendo a comparação com os efeitos sutis e subletais já observados em células tratadas com plástico, em trabalhos anteriores do grupo. Assim, os achados desta etapa consolidam as bases para a aplicação de uma abordagem fenotípica comparativa, potencialmente capaz de revelar os mecanismos celulares acionados pela exposição a nanoplásticos.
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Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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