Aproximadamente 40% da produção agrícola mundial é perdida todos os anos devido a ação de pragas e de doenças em plantas cultivadas, o que ocasiona a redução de mais de 220 bilhões de dólares na economia global (Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura- FAO, 2022). Os defensivos químicos são amplamente utilizados para minimizar tais prejuízos, sendo anualmente consumidos no Brasil acima de 300 mil toneladas desses produtos (Embrapa, 2021). Entretanto, os defensivos químicos podem gerar subprodutos danosos ao ecossistema, além de interferir na saúde de quem o aplica e na microbiota do solo e promover resistência em organismos-alvo (Aktar et al, 2009; Ahmad et al, 2024). Desse modo, surge a necessidade de desenvolver produtos biológicos capazes de controlar patógenos agrícolas e que, ao mesmo tempo, sejam menos nocivos ao ecossistema e aos seres vivos. O mel é um ambiente hiperosmótico que contém uma microbiota tolerante a condições severas, sendo esta naturalmente produtora de compostos antimicrobianos devido às relações de competição e de antagonismo interespecífico, que visam a obtenção de espaço e de nutrientes ou a defesa contra patógenos. Portanto, o mel se configura como um local de significativo potencial para a bioprospecção de microrganismos com propriedades antimicrobianas (Brudzynski, 2021). Assim, realizamos a bioprospecção de 5 méis comerciais diferentes, sendo 1 deles produzido por Tetragonisca sp. e os demais por Apis mellifera, com o intuito de verificar a existência de microrganismos nessas amostras. Plaqueamos as amostras diluídas em diferentes meios de cultura sólidos: LB, TSA, TMA, YPD e HS. Após a análise do fenótipo das colônias, contabilizamos cerca de 53 isolados bacterianos e 10 isolados fúngicos. Realizamos testes de disco-difusão para avaliar se os microrganismos bioprospectados dos méis possuíam capacidade de antibiose. Primeiramente fizemos os testes contra Escherichia coli DH5alpha e Saccharomyces cerevisiae BY4741/yEP-GAP-mCherry, ambos microrganismos modelo. Depois de obter esses resultados preliminares, submetemos os isolados ao teste de disco-difusão contra 6 fitopatógenos, sendo eles: a bactéria Xanthomonas citri e os fungos Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum e Botrytis cinerea. Vários microrganismos bioprospectados apresentaram atividade antimicrobiana contra os microrganismos modelo e os fitopatógenos, inferido pela presença de halos de inibição no local em que foi inoculado o isolado. Os resultados dos testes também indicaram que a E. coli e a S. cerevisiae são efetivas para a triagem inicial, tendo forte correlação com a inibição posterior dos fitopatógenos. Os isolados M2.7 e M3.18 demonstraram, dentre os demais bioprospectados, maior atividade antibiótica e antifúngica. Desse modo, realizamos testes de cultura dupla do M2.7 e M3.18 contra cada um dos fungos fitopatogênicos com o objetivo de calcular a porcentagem de inibição destes, comparando suas eficiências com a de uma cepa de Bacillus subtilis comercializada como agente de controle biológico. Ambos isolados apresentaram taxa de antibiose superiores ou equivalentes à eficiência do produto comercial formulado com B. subtilis. Os microrganismos M2.7 e M3.18 conseguiram inibir o crescimento de R. solani e de B. cinerea com maior eficácia quando comparado ao produto comercial, sendo que para B. cinerea houve diminuição na esporulação após aplicados os isolados. Para S. sclerotiorum, os microrganismos bioprospectados resultaram em capacidade antifúngica similar àquela da formulação comercial. Também foi analisada a morfologia das hifas de cada fitopatógeno em cultura com os dois isolados, revelando alterações induzidas por estresse nessas estruturas, como dilatação, fragmentação e aumento no número de ramificações e septos. A identificação molecular dos microrganismos M2.7 e M.3.18, através dos bancos de dados EZBioCloud 16S e NCBI BLASTn, foi realizada com o sequenciamento do gene codificador para 16S rRNA, permitindo que os isolados fossem classificados no gênero Bacillus, entretanto, com baixa resolução a nível de espécie. Com o objetivo de aumentar a precisão da identificação, realizamos o sequenciamento do gene codificador para a DNA girase A, através do qual ambos os isolados M2.7 e M3.18 revelaram alta similaridade com as espécies Bacillus velezensis e Bacillus amyloliquefaciens. As próximas etapas a serem efetuadas no projeto envolvem: o sequenciamento do genoma completo dos microrganismos M2.7 e M3.18 para identificação dos potenciais genes responsáveis pela síntese dos antimicrobianos e, posteriormente, a deleção de tais genes através da técnica de CRISPR/Cas9 para confirmar se, de fato, eles estão correlacionados à produção das moléculas antimicrobianas. Esse estudo salienta que fontes não convencionais de bioprospecção, como o mel comercial, podem conter uma microbiota diversa e contribuir para o avanço da agricultura sustentável. Bem como, os isolados M2.7 e M3.18 são microrganismos promissores para futura otimização e formulação de produtos biológicos devido as suas propriedades antibióticas e antifúngicas.
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