Título: Glândula mamária: da morfologia à expressão de receptores hormonais e marcador de proliferação em camundongos primíparos e multíparos na prenhez e pós-parto.
Autores: Fernanda Silva de Oliveira, Rafaela Ferraz Teixeira, Lizandra Maia de Sousa, Sílvio Roberto Consonni.
Afiliação: Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, Instituto de Biologia, Unicamp.
A glândula mamária é formada por um tecido que passa por grandes mudanças ao longo da vida de mamíferos, sendo dependente de diversos fatores endógenos e exógenos. Em fêmeas, o desenvolvimento desse órgão só se completa após a ocorrência de gestação e lactação, onde os tecidos apresentam máximas alterações morfológicas orquestradas pelas variações hormonais. Essas alterações podem ter efeito protetor contra o desenvolvimento de câncer de mama, principalmente quando associado a fatores como a idade da primeira gestação e o número de partos. Essa proteção é observada tanto em humanos quanto em roedores. A glândula mamária de nulíparas é composta por uma grande quantidade de células progenitoras que, durante a gravidez se diferenciam em células epiteliais secretoras e células mioepiteliais. A proteção conferida pela gravidez pode estar associada a essa diferenciação celular, a qual diminui a capacidade proliferativa das células, reduzindo a susceptibilidade ao surgimento de células cancerígenas. Assim, o uso de camundongos como modelo de estudo pode permitir o melhor entendimento e a caracterização das mudanças celulares e teciduais associadas à idade e ao número de gestações e partos. Assim, o objetivo deste projeto é caracterizar o remodelamento tecidual da glândula mamária, e avaliar os marcadores de proliferação celular e de receptores hormonais de estrogênio, progesterona, prolactina e relaxina por imuno-histoquímica em camundongos primíparos e multíparos durante a prenhez e no pós-parto.
Para isso, foram obtidos do CEMIB, camundongos fêmeas virgens C57BL/6J jovens (três meses de idade) com massa corporal de 25-30 g e fêmeas constituintes da “matriz reprodutiva” (mínimo 5 partos) com aproximadamente 8 meses de idade, massa corporal de aproximadamente 40 g. Foi oferecida oportunidade de acasalamento para ambos os grupos e o dia, no qual o “plug” vaginal foi encontrado, tornou-se o 1º dia de gestação. Assim, nos dias 12 (D12) e 18 (D18) de prenhez, 3 (3dpp) e 21 (21dpp) dias pós-parto, as glândulas mamárias inguinais de cada animal foram coletadas. Foram utilizados três animais de cada grupo para cada técnica. As amostras foram fixadas por imersão em paraformaldeído 4% (Merck, Darmstadt, Germany) em solução-tampão de fosfato salino 0,1 M (PBS, pH 7,4), durante 24 h a 4 ºC. As amostras de tecido mamário foram desidratadas em bateria de álcoois, diafanizadas em xilol e embebidos em parafina (Paraplast Kit embedding, Sigma, St Louis, MO, EUA) a 58 ºC. Cortes de 5 a 7 µm foram corados pelo método de Hematoxilina e Eosina. Até o momento, foi realizada a análise imuno-histoquímica do material para imunolocalização dos receptores de hormônio ER-beta, relaxina (LGR7) e para o marcador de proliferação Ki-67. As fotomicrografias foram adquiridas em fotomicroscópio Eclipse 800 (Nikon, Japan), utilizando-se câmera digital P6FL PRO (Optika, Itália) e software OPTIKA PROVIEW. A avaliação dos tipos celulares e da organização da matriz extracelular foi realizada de forma qualitativa. A quantificação das imagens de imuno-histoquímica foi feita pela análise de marcação por área no programa QUPATH.
Do D12 ao 21dpp, a análise por microscopia de luz do material corado pelo método de Hematoxilina e Eosina revelou um aumento significativo na porção secretora em relação ao estroma adiposo. Tanto no grupo de primíparas quanto de multíparas, houve um aumento da área ocupada pelas porções dos ductos e dos alvéolos em relação ao D12. No pós-parto, em 3dpp e 21dpp, a glândula mamária é constituída em quase sua totalidade por ductos e alvéolos e o estroma adiposo encontra-se reduzido. Ao se comparar D12 multíparas às D12 primíparas e, foi possível observar que as multíparas apresentam um maior número de ramificação e desenvolvimento dos alvéolos e ductos. As próximas análises visam realizar as mesmas comparações entre as multíparas e primíparas dos grupos D18, 3dpp e 21dpp. A quantificação das fotomicrografias de imuno-histoquímicas em primíparas, permitiu observar que há aumento na marcação de células positivas para ER-beta à medida que a gestação avança e no período pós-parto. Foi observado também, um pico de células que expressam LGR7 em 3dpp. Em relação ao Ki-67, observou-se um grande número de células marcadas em D12 e 3pp, enquanto o menor valor mostrou-se em 21 dpp. As próximas análises de quantificação versarão os demais grupos.
Nossos resultados preliminares revelam que uma gestação induz o desenvolvimento da glândula para a formação da porção secretora, a partir do crescimento de alvéolos e ductos que, durante a lactação, são responsáveis pela produção e excreção do leite. A análise de imuno-histoquímica do material revela as alterações no padrão de expressão e de localização dos receptores hormonais que ocorrem na glândula mamária durante uma gestação e no pós-parto em primíparas, reforçando a importância da regulação espaço-temporal desses hormônios para a remodelação tecidual durante esse período. Nas próximas etapas, será realizada a análise de imuno-histoquímica em fêmeas multíparas. Apesar das alterações morfológicas, de ciclo celular e de expressão de receptores hormonais ocorrerem com sucesso em primíparas e multíparas, a maior quantidade de alvéolos e de ductos em D12 de fêmeas multíparas, bem como os resultados preliminares da marcação de Ki-67 corroboram a hipótese de proteção ao desenvolvimento de células cancerígenas, já que a ocorrência de múltiplas gestações leva a um processo de morfogênese e de diferenciação tecidual que se conserva, mesmo após o fim do período de lactação.
Ainda, nas etapas seguintes do trabalho, de forma semelhante ao realizado para o método de Hematoxilina e Eosina, será feita a coloração tricrômico de Masson para avaliação da remodelação tecidual no estroma da glândula mamária nos grupos de fêmeas primíparas e multíparas. Ainda, será realizada a imunolocalização de receptores de ER-alfa, progesterona (PR) e prolactina (PRLR) e a técnica de whole-mouting para avaliação morfológica da glândula mamária.
Número do registro no CEUA: 6658-1/2025
Número do Processo na Fapesp: 2024/20898-6
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