No intuito de mitigar os efeitos das mudanças climáticas no planeta, torna-se cada vez mais importante a busca por fontes alternativas de energia, desde fontes naturalmente inesgotáveis, como a energia solar e eólica, assim como produtos potencialmente renováveis, como o etanol e o hidrogênio (H2). Este último, devido a sua alta quantidade de energia por quilograma produzida, se mostra como potencial “combustível do futuro”. No entanto, quanto à sua produção atualmente, os combustíveis fósseis respondem por 96% da produção global. Consequentemente, muito se tem estudado a respeito da utilização de técnicas que provoquem menos impactos ambientais na produção de hidrogênio, com destaque para o biohidrogênio, este produto da ação de microrganismos fermentadores em biomassa residual. As vias metabólicas que implicam na produção fermentativa de hidrogênio são bem conhecidas e detalhadamente caracterizadas. Em bactérias anaeróbias facultativas, a capacidade de produção de H2 reside na atividade da piruvato formato liase (PFL), enzima capaz de separar o piruvato formado pela glicólise em formato e acetil-CoA, e da hidrogênio liase (FHL), a qual cliva o formato recém produzido em H2 e CO2?, sobre condições anaeróbicas. Por outro lado, em determinadas bactérias termofílicas, a capacidade de produção de hidrogênio reside na utilização do poder redutor do NADH intracelular. Nestes indivíduos, a partir da ação da NADH ferredoxina oxidoredutase (NFOR), a Fdox é reduzida pelo NADH formado pela glicólise. Os elétrons presentes na Fdrd formada são então transferidos para prótons H+ pela hidrogenase dependente de ferredoxina (HydA), formando assim o H2. Nesse sentido, sabendo da capacidade de produção de NADH pelo Ciclo de Krebs, este poderia ser uma valiosa fonte da molécula para a produção de H2 pela ação da NFOR. Uma vez induzido em anaerobiose, o ciclo passará a liberar NADH no meio intracelular, este que, devido a ausência de O2, não será redirecionado para a cadeia transportadora de elétrons, podendo servir como substrato para a produção de H2. Dentre os organismos capazes de realizar o Ciclo de Krebs, destaca-se a bactéria anaeróbia facultativa Escherichia coli, esta amplamente estudada e descrita metabolicamente. Tendo isso em vista, a partir da expressão da enzima NFOR no metabolismo de E.coli, espera-se que a mesma, quando em anaerobiose, possa transformar o NADH produzido pelo Ciclo de Krebs induzido em H2. Sendo assim, objetivamos desenvolver um modelo computacional preditivo capaz de avaliar a produção de biohidrogênio pela via da NFOR introduzida na bactéria E. coli, quando induzida a realizar o Ciclo de Krebs em anaerobiose. Para tal, como etapa preparatória para a criação do modelo preditivo, testou-se a hipótese de que, quando exposta a altas concentrações de NADH, a via da NFOR recém introduzida na bactéria será capaz de converter o NADH intracelular em H2. Deste modo, a partir do modelo de reconstrução metabólica iJO1366 de Escherichia coli, foram realizadas simulações com o auxílio do pacote COBRApy, visando modificar a rede metabólica bacteriana frente a hipótese a ser testada. Dessa maneira, com o modelo iJO1366, realizaram-se diferentes séries de Análises de Balanço de Fluxo Dinâmicas (dFBA), estas capazes de averiguar os fluxos enzimáticos e metabólicos da bactéria quando exposta a diferentes configurações de substratos e enzimas, ao longo de determinado intervalo de tempo. Como controle, realizamos primeiramente uma dFBA no modelo original, sendo esta uma simulação da produção de H2 pela bactéria selvagem, quando na ausência de O2. Com a análise, observamos uma baixa taxa de produção de H2 pela bactéria selvagem (0.45 g/L). Constatamos também quais as principais reações e enzimas envolvidas na produção de NADH pela bactéria, sendo 95% de sua produção proveniente da ação da Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPD), durante a glicólise. Sendo a piruvato desidrogenase (PDH) uma enzima importante para a produção de NADH, a mesma foi induzida a funcionar em anaerobiose, uma vez que, normalmente, esta não atua quando na ausência de oxigênio. Além disso, visando maximizar a quantidade de NADH disponível intracelularmente, a via fermentativa da bactéria foi nocauteada, através do nocaute das enzimas d-lactato desidrogenase (LDH_D) e l-lactato desidrogenase (L_LACD3). Com isso, a partir do aumento da produção de NADH, observamos um aumento considerável na taxa de produção de etanol (5.34 g/L), somado a uma diminuição da produção de H2 (0.12 g/L). Tendo isso em vista, na busca de maximizar a produção de H2, realizamos um nocaute na principal enzima envolvida na produção de etanol, a acetaldeído desidrogenase (ACALD), causando um efeito instantâneo na produção de H2, o qual teve um aumento de, aproximadamente, 107% de produção (0.58 g/L). Por fim, dado o aumento do NADH disponível intracelularmente, foi introduzida a via da NFOR na bactéria, sendo avaliada a taxa de produção de H2 pela mesma. Neste caso, observamos uma leve diminuição na produção de H2 (0.57 g/L), mesmo o NADH produzido sendo de fato consumido pela NFOR.
A partir disso, destacamos que a via da NFOR, mesmo em condições de altas concentrações de NADH, não é capaz de converter a maior parte do metabólito em H?, sendo sua produção baseada principalmente na atuação da via nativa da bactéria. Dessa maneira, outros processos metabólicos devem ser considerados na avaliação da via da NFOR, tais como a influência da termodinâmica das reações e as concentrações enzimáticas necessárias para sua manutenção. Por outro lado, é clara a existência de uma influência direta da enzima PDH sobre a capacidade de produção de H?, sendo esta uma excelente candidata à superexpressão em experimentos in vitro. Em relação à via nativa da bactéria, evidenciamos também que, mesmo o NADH não participando diretamente dessa via, ao ser redirecionado da produção de etanol, exerce influência sobre a FHL. Dessa forma, torna-se evidente a necessidade de modificações subsequentes à indução do Ciclo de Krebs em condições anaeróbicas, com o objetivo de canalizar o NADH para a NFOR. Sendo assim, este estudo serve como base para futuras experimentações in vitro, sendo capaz de predizer condições enzimáticas favoráveis ao aumento do rendimento de H? produzido por substrato consumido.
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