O desenvolvimento dos animais é determinado por gradientes de morfógenos, os quais regulam a expressão gênica e definem o estado, o comportamento e a diferenciação das células. A sinalização parácrina mediada pelo morfógeno SHH (Sonic Hedgehog) e seu homólogo Hedgehog (Hh), em Drosophila melanogaster, tem papel na comunicação intercelular de órgãos e tecidos durante o desenvolvimento, na homeostase, e na progressão de diversas doenças, incluindo o câncer. Esse tipo de sinalização é mediada por contato celular e citonemas (filopódios especializados em sinalização) e se assemelha a sinalização neuronal. No entanto, os achados até agora não evidenciaram um acúmulo de vesículas “pré-sinápticas” contendo morfógenos de sinalização parácrina nos citonemas de células não neuronais. Por isso, no presente projeto visamos caracterizar o padrão de exportação ao nível celular e subcelular de Hh in vitro através de um sistema de detecção de exportação de dois componentes: (1) Proteína localizadora fusionada com GFP1-10 e (2) Hh fusionado com GFP11(7x). O sinal fluorescente é gerado mediante aproximação dos dois componentes que reconstituem a proteína GFP, irreversivelmente, e revela a localização do Hh, em função da proteína localizadora. A exportação do Hh será identificada pelo do sinal GFP do localizador GFP1-10-CD4, que é uma proteína transmembrana contendo o “GFP1-10” no domínio extracelular. Através desse método e imagens de microscopia confocal, visamos caracterizar in vitro e in vivo a rota biosintética de Hedgehog.
Buscaremos caracterizar o padrão de exportação e sinalização do morfógeno através de análises in vivo, utilizando estratégias de cruzamentos com o organismo modelo Drosophila melanogaster transgênicas com genes repórteres, engenheirados para o observação de exportação e transferência do morfógeno para células vizinhas. Os diferentes estoques dessas moscas serão mantidos no laboratório e a partir deles trabalharemos com múltiplas ferramentas, estabelecendo cruzamentos que resultarão em larvas de interesse.
Para analisar a entrega do morfógeno Hh, utilizamos sistemas de expressão direcionada com os drivers GAL4 e LexA (ou LHG), que induzem a expressão das diferentes partes do sistema split-GFP na linhagem transgênica UAS-CD4GFP1-10, LexOp-HhGFP11(7x)/TM6B. Nessa configuração, o fator de transcrição GAL4 se liga ao promotor UAS, promovendo a expressão da proteína transmembrana CD4 fundida ao fragmento GFP1-10. Paralelamente, LexA ou LHG se ligam ao promotor LexOp, induzindo a expressão do morfógeno Hh ligado ao fragmento GFP11 (7x).
As interações entre esses componentes são avaliadas na geração F1, obtida a partir do cruzamento de moscas transgênicas das linhagens contendo os drivers de interesse. O cruzamento é realizado por meio da seleção de fêmeas virgens da linhagem driver (ci-Gal4/cyo;hh-LexA/TM6B) e sua transferência para um novo vial de vidro contendo machos de outro genótipo (UAS-CD4:GFP1-10, LexOp-Hh:GFP11(7x)/TM6B), então selecionaremos, através da ausência de marcadores balanceados, larvas L3 vagantes da geração F1 com genótipo de interesse (ciGal4/+; hh-LexA/LexOp-hhGFP11x,UAS-CD4GFP1-10x).
Nesse genótipo, o promotor ci dirige a expressão de GAL4 na região anterior do disco imaginário da asa, onde ativa a expressão da proteína CD4:GFP1-10. Além disso, o fator de transcrição LexA, sob controle do promotor hh, será expresso no compartimento posterior, promovendo a expressão do morfógeno Hh: GFP11. Dessa forma, permite-se a expressão nas duas regiões do split-GFP em regiões não sobrepostas de tecidos adjacentes no disco da asa, fazendo com que a reconstituição do sinal fluorescente de GFP ocorra na aproximação física entre os dois domínios, levantando hipóteses para a possível transferência do morfógeno hedgehog para outra região por meio de citonemas. As larvas no estágio L3 obtidas desse cruzamento serão analisadas quanto à fluorescência no disco da asa. Dessa forma, serão combinadas múltiplas ferramentas e padrões de rastreamento do morfógeno, garantindo também interpretações a nível tecidual.
As caracterizações in vitro e in vivo do projeto serão instrumentais para avançar nos estudos de regulação da exportação de Hh, mediada por proteoglicanos de heparam sulfato, a qual esse projeto de iniciação científica está inserido. Os achados deste projeto devem, pela primeira vez, caracterizar o padrão de exportação de Hedgehog no nível celular e tecidual.
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Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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