A Síndrome de Pitt-Hopkins (PTHS) é uma condição genética dentro do espectro autista causada pela haploinsuficiência do gene TCF4 (Transcription Factor 4). Indivíduos portadores dessa doença apresentam déficit cognitivo, atraso motor e ausência de fala. A proteína TCF4 é um fator de transcrição que atua, dentre outros momentos, durante o neurodesenvolvimento. Devido à sua natureza regulatória, entende-se que mutações no TCF4 podem afetar a expressão de outros genes ao longo do desenvolvimento. Assim, o estudo de outras proteínas expressas no sistema nervoso é de grande importância para desvendar os mecanismos que levam à ocorrência dos sintomas dessa síndrome, por meio de técnicas abrangentes como transcritômica e proteômica.Ao analisar o transcritoma de células neurais derivadas de pacientes com PTHS, nosso grupo descobriu expressão alterada de NOVA1 e RBFOX1, em dados de RNA-seq bulk e single-cell. Tendo em vista que NOVA1 e RBFOX1 codificam reguladores do processo de splicing de RNAs e que mudanças na expressão destes genes já foram correlacionadas com doenças do espectro autista, nós hipotetizamos que a desregulação na expressão destes genes pode levar a alterações no processo de splicing na PTHS, ocasionando consequentemente mudanças na abundância de transcritos (e suas isoformas proteicas correspondentes) de diversos genes, o que poderia contribuir para as consequências fenotípicas observadas em pacientes portando PTHS.O objetivo deste estudo tem sido realizar a avaliação do perfil de splicing alternativo, de forma global, nos transcritomas de células derivadas de pacientes PTHS, incluindo células progenitoras neurais e neurônios. Para tanto, foram utilizados dados brutos oriundos do sequenciamento de RNA bulk de nosso grupo, obtidos a partir de 4 pacientes com PTHS e respectivos pais de mesmo sexo, como controles. Para identificar os eventos de splicing diferencial entre pacientes e controles, utilizamos o programa rMATS-turbo, que resulta em uma métrica conhecida como PSI, que mede a taxa de splicing do gene. Eventos de splicing significativamente alterados foram triados, procurando eventos de genes relacionados ao neurodesenvolvimento ou à migração celular e sinapse. Os eventos de splicing escolhidos para posterior investigação passaram por uma análise de domínios proteicos. Nossa abordagem revelou que um transcrito que codifica uma isoforma solúvel da proteína Neurexina-3 (codificada pelo gene NRXN3) é consideravelmente mais expresso no controle do que no paciente com PTHS. Já no paciente, foi predito que ocorre expressão predominante de outro transcrito, produzido através de splicing alternativo, que codifica uma isoforma transmembrana da Neurexina-3. Devido ao fato de que a Neurexina-3 é uma proteína expressa nas fendas sinápticas, o desbalanço entre as formas transmembrana e solúvel pode levar à formação aberrante de sinapses na PTHS. Adicionalmente, extrairemos uma coleção de mRNAs a partir de culturas 2D de células neurais derivadas de pacientes e pais do mesmo sexo (controles), seguido de síntese de cDNA. Com isso, será possível determinar o perfil de splicing da Neurexina-3 através de ensaios de RT-qPCR para o gene NRXN3 utilizando primers específicos para cada isoforma. Ademais, confirmaremos a existência de cada evento de splicing predito pelas análises in silico, mediante experimentos de RT-PCR tradicionais. As informações obtidas com este projeto levarão à elucidação da patologia molecular que acompanha a PTHS, podendo futuramente auxiliar na identificação de alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novas estratégias específicas para o tratamento da Síndrome de Pitt-Hopkins, para benefício dos pacientes afetados por esta doença debilitante.
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