Vesículas de membrana externa carregadas com violaceína e sua atividade inibitória sobre Staphylococcus aureus
Júlia Cascaldi Miranda1,2; Marcelo Brocchi2; Genesy Pérez Jorge2,3; Yessica Paola Jaimes-Florez2; Marina Flóro e Silva2, Isabella Carolina Rodrigues Dos Santos Goes2.
[1] Biomedicina, Pontifícia Universidade Católica de Campinas, Campinas, SP, Brasil
[2] Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana - Instituto de Biologia – UNICAMP
[3] Research Group Statistics and Mathematical Modeling Applied to Educational Quality (GEMMA), University of Sucre, Sincelejo, Sucre, Colombia
Introdução:
Infecções causadas por Staphylococcus aureus representam um desafio significativo de saúde pública que tem sua história pautada na busca por novos antibióticos, uma vez que essa bactéria tem constantemente adquirido resistência a eles. Na busca de novas drogas antimicrobianas, destaca-se a violaceína, um pigmento produzido por diferentes espécies de bactérias Gram-negativas, que possui ação antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, particularmente S. aureus.
Uma questão a ser considerada no uso da violaceína como antibacteriano é a toxicidade dessa molécula a células eucarióticas. Assim, o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a administração segura é de extrema relevância. Uma maneira de contornar a toxicidade é o desenvolvimento de estratégias de encapsulamento da violaceína, buscando diminuir sua concentração em terapia.
Linhagens de Salmonella enterica mutantes para os genes tolRA exibem fenótipo hipervesiculado, com aumento na formação de vesículas de membrana externa (OMVs). A introdução de mutações no gene msbB diminui a toxicidade devido à modificação no lipídeo A do LPS, potencializando a capacidade de vesículas produzidas por essas bactérias em carregar violaceína.
Portanto, OMVs produzidas por mutantes ?tolRA e ?msbB representam uma estratégia promissora para produção de vesículas carreando violaceína no tratamento de infecções por S. aureus. Este projeto visa explorar essa estratégia, utilizando técnicas de microbiologia e biologia molecular.
Objetivos:
O objetivo geral é verificar se OMVs de S. enterica e E. coli carregadas com violaceína apresentam atividade antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus. Deleção do gene msbB em S. enterica Typhimurium ?tolRA por transdução; Avaliar a atividade antimicrobiana de OMVs carregadas ou não com violaceína sobre S. aureus in vitro e in vivo, no modelo de Galleria mellonella.
Métodos:
Neste estudo serão utilizadas as linhagens bacterianas S. enterica ATCC 14028?tolRA, S. enterica 14028?msbB, ClearColi® BL21 (DE3) e S. aureus 43300. A linhagem S. enterica ?tolRA apresenta uma marca de resistência, cuja remoção é necessária para viabilizar a construção do mutante duplo ?tolRA?msbB.
O mutante S. enterica ?tolRA?msbB será construído usando o sistema ? Red. A mutação msbB será mobilizada para a linhagem S. enterica ?tolRA via transdução generalizada com o fago P22 HT. A confirmação será feita por PCR e, posteriormente, será feito um teste em meio Evans blue-uranine (EBU) para verificar a ausência.
Para a produção de violaceína, o plasmídio pBAT_vioABCDE será introduzido nas linhagens bacterianas S. enterica ?tolRA ?msbB e ClearColi® BL21 (DE3) por eletroporação. As bactérias serão cultivadas até a fase exponencial. A expressão de violaceína será induzida com isopropil-?-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e as OMVs extraídas.
Para avaliar a capacidade das OMVs de inibir o crescimento de S. aureus, será determinada a concentração inibitória mínima (CIM). Por fim, será avaliada a toxicidade e a eficácia antimicrobiana das OMVs carregadas com violaceína em modelo in vivo utilizando larvas de Galleria mellonella.
Resultados:
Foi realizado o preparo das células eletrocompetentes de S. enterica Typhimurium ?tolRA e posterior eletroporação do plasmídeo pCP20 a fim de eliminar a resistência a canamicina.
A transdução para obtenção do mutante foi realizada com sucesso, conforme confirmado por PCR. A subsequente transformação desta linhagem com o plasmídio pBAT_vioABCDE também foi confirmada por PCR. Também houve sucesso na transformação de Clear Coli BL21 (DE3) com pBAT_vioABCDE.
Discussão e conclusão:
Os resultados obtidos até o momento demonstram a viabilidade da construção de linhagens mutantes de S. enterica e de E. coli transformadas com o plasmídeo pBAT_vioABCDE, e espera-se concluir que essas linhagens sejam capazes de produzir OMVs carregadas com violaceína.
Comissão Organizadora
Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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