O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é caracterizado por déficits cognitivo e motor, atraso de linguagem, inabilidade intelectual, entre outros aspectos fenotípicos que sugerem ser oriundos a partir do desenvolvimento cortical alterado.
Entretanto, ainda é desconhecido os mecanismos moleculares e celulares da patofisiologia do TEA. Nosso estudo tem como enfoque a Síndrome de Pitt-Hopkins (PTHS), presente no TEA, causada pela haploinsuficiência do Fator de Transcrição 4 (TCF4). Utilizamos células progenitoras neurais derivadas de paciente (NPCs) em cultura 2D e organóides cerebrais para demonstrar que células PTHS apresentam redução de proliferação de NPCs e diferenciação neuronal prejudicada.
Essas análises foram feitas em células e organóides derivados de 5 pacientes PTHS masculinos e seus respectivos pais como controles, escolhidos baseados na disponibilidade de amostras e análise de poder estatístico, indicando que o tamanho de efeito observado é alto e que o tamanho amostral mínimo de 4 indivíduos é necessário.
Para medir a proliferação de progenitoras neurais, tratamos as NPCs com EdU, seguido de avaliação por citometria de fluxo. Esse experimento mostrou que progenitoras neurais PTHS apresentam uma redução da metade da taxa de proliferação. Além disso, cultivamos NPCs e diferenciamos elas em neurônios, seguido de imunohistoquímica com os anticorpos SOX2 e MAP2 para calcular a razão entre o número de progenitores SOX2+ e neurônios MAP2+. Este experimento revelou que culturas neurais PTHS exibem uma significante redução no número de progenitores em relação ao conteúdo de neurônios diferenciados. Ademais, dados de sequenciamento de RNA single-cell provenientes de organóides corticais PTHS evidenciam uma redução geral no conteúdo de neurônios. Curiosamente, esses defeitos na proliferação e diferenciação estão em paralelo com o aumento da expressão de ID1 e ID3, membros da família dos fatores de transcrição bHLH que perderam o domínio de ligação ao DNA, e que inibem a diferenciação de diferentes tipos celulares quando altamente expressos. Especificamente, observamos que a expressão de ID1 e ID3 é aproximadamente 6 vezes maior em progenitores neurais de organóides PTHS em relação ao genótipo saudável. Além disso, sequenciamento de RNA-bulk revelou um amento da expressão entre 3 a 4 vezes de ID1 e ID3 de NPCs PTHS em cultura 2D. Finalmente, fizemos o knockdown do TCF4 utilizando oligonucleotídeos antisenso (ASOs) em neurônios em diferenciação, seguido de avaliação via qPCR para demonstrar que a redução da expressão do TCF4 leva ao aumento da expressão de ID1 e ID3. Esses resultados sugerem que a haploinsuficiência do TCF4 acomete a diferenciação neuronal através do aumento da expressão dos IDs. Nosso estudo promove o esclarecimento de mecanismos patofisiológicos do transtorno do espectro autista e contribui com futuros alvos para terapia farmacológica.
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Estudantes de biologia da Universidade Estadual de Campinas.
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